免疫学实验方案重要.docVIP

抗体的制备 实验目的 掌握抗体制备的实验原理和方法。 实验原理 实验试剂及器材 操作步骤 将兔放入一个特造的木匣或笼内，耳露于箱（笼）外，也可由另一人捉住兔身。剪去耳缘的毛，用少许二甲苯涂抹耳廓，30s后，耳血管扩张、充血。用手轻拉耳尖，以单面剃须刀或尖的手术刀片，快速切开动脉或静脉，血液即流出，每次可收集30～40ml 。然后用棉球压迫止血，凝血后洗去二甲苯。放血过程中要严格按无菌要求进行。收集的血液，4000rmp离心10min，弃上清，得到血浆，即抗体。 抗体的制备、鉴定、纯化及纯度鉴定 一、实验目的 ⒈ 加深对抗体基本知识的了解。⒉ 了解多克隆抗体的制备及纯化的基本方法。⒊ 了解免疫电泳的基本过程和实验依据。1、抗体的制备一、实验原理当将抗原注射入实验动物体内时，一系列抗体生成细胞会不同程度的与抗原结合，受抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体，这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗体。多克隆抗体中不同的抗体分子可以以不同的亲和能力与抗原分子表面不同的部分—抗原决定簇相结合。将抗原导入敏感动物体内后，可刺激网状内皮细胞系统，尤其是淋巴结和脾脏中的淋巴细胞大量增殖。如图所示，实验动物对初次免疫和二次免疫的应答有明显的不同。通常初次免疫应答往往比较弱，尤其是针对于易代谢，可溶性的抗原。首次注射后大约7天，在血清中可以观察到抗体但抗体的浓度维持在一个较低的水平，在大约10天左右抗体的滴度会达到最大值。但同种抗原注射而产生的二次免疫应答的结果明显不同，和初次免疫应答相比抗体的合成速度明显增加并且保留时间也长。免疫应答的动力学结果取决于抗原和免疫动物的种类，但初次和二次免疫应答之间的关系是免疫应答的一个重要特点。三次或以后的抗原注射所产生的应答和二次应答结果相似：抗体的滴度明显增加并且血清中抗体的种类和性质发生了改变，这种改变被称为免疫应答的成熟，具有重要的实际意义。通常在抗原注射4-6周后会产生具有高亲和力的抗体。二、实验材料及试剂 ⒈ 实验动物成年兔。⒉ 实验器材特制兔盒；刀片；25G针头；1ml注射器；20 ml 血液收集管；药铲；离心机以及塑料离心管；加样器及加样管；烧杯。四、实验步骤 ⑴ 将家兔轻轻放入固定架上,二甲苯涂于耳部血管的上中部，用刀片倾斜45°在该处切出0.23cm-0.3cm的切口使血液能自由的流出。用消毒后的管收集滴出的血液，若在结束之前出现凝固可用温水轻擦切口处，再继续收集。收集适量血液后可用消毒后的纱布轻擦患处，轻按患处10秒-20秒确定血流停止后方可结束。⑵ 将血液在37°C恒温箱中放置30分钟，再在4°C放置过夜。用药铲将血凝块从管壁上拨落，将血液转移至塑料离心管中，4°C，10,000g离心10分钟，收集上清液即为抗血清，可在-20°C保存数年。五、实验结果获得了抗体，利用免疫电泳方法检查抗体产生情况。 抗体的测定——酶联免疫吸附法 实验原理 免疫酶技术是利用酶标记抗体或抗原，以检测相应抗原或抗体的一种免疫学标记技术。其原理是酶与抗体或抗原结合后既不改变抗体或抗原的特异性及免疫反应性，也不影响酶的催化效能。当存在相应酶底物时，酶能催化产生有颜色的产物，颜色的有无及深浅能反映相应的抗原或抗体是否存在及其量的多少。 酶联免疫吸附试验（ELISA）是一类常用的免疫酶技术，可用于测定抗体，也可用于检测抗原。该实验常用的酶为辣根过氧化物酶，底物为邻苯二胺（OPD）。实验方法有间接法、双抗体夹心法和抗原竞争法。 实验器材及试剂 1、抗人IgG抗体（常用羊或兔抗人IgG抗体） 2、已知IgG含量的参考蛋白。 3、待检兔血清。 4、辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体。 5、包被液：pH 9.6 0.05mol/L碳酸盐缓冲液。 6、稀释液：含10%牛血清白蛋白pH 7.4 0.01mol/L PBS。 7、洗涤液：pH 7.4 0.01mol/L PBS-吐温20。 8、底物溶液：OPD-H2O2 9、终止液：2mol/L H2SO4。 10、96孔酶标反应板。 三、实验步骤 1、包被：将羊或兔抗人IgG抗体用包被液作适当稀释（1:100），在96孔反应板中每孔加100(l，置370C 2h后再移置40C过夜。 2、洗涤：将96孔反应倾去包被液，用洗涤液PBS-吐温20加满各孔，置3min，倾去，如此反复3次。 3、加样： (1)将已知IgG含量的参考蛋白用稀释液配成不同的梯度浓度，分别加入1-7孔，每孔100(l。 (2)第8孔加待检血清100(l (3)第9孔加阴性对照血清100(l。 (4)第10孔加PBS-T20液100(l，为空白对照。