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PCR技术 PCR技术的基本原理 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，在温度降至55℃左右时，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2～4分钟，在一个由计算机控制的循环加热器上经过三十个循环，就可以把原来的样品精确地扩增了２的３０次方倍。扩增产物的量可用下列公式表示:C＝C0 (1+P)n 。其中：C为扩增产物量,C0 为起始DNA量, P为扩增效率, n为循环次数。　　在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期(Plateau)会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应，减少非特异性产物。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量可增加一倍（理论上）。对于某些扩增片段很短的PCR反应，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。 PCR反应体系与反应条件 PCR反应体系试剂：1、反应缓冲体系：提供PCR反应所必需的合适的酸碱度和某些离子。目前最常用的缓冲液是10~50mmol/L的Tris-HCl (pH8.3~8.8，20℃)，在72℃(通常PCR反应延长阶段的温度)时，其pH值为7.2左右，故在实际的PCR反应体系中，其pH值变化于 6.8~7.8之间。一般体系为：500mmol/L KCl、10mmol/L Tris-HCl(pH8.4, 20C)、150mmol/L MgCl。Tris-HCl用于调节反应体系pH值，使Taq酶在偏碱性环境中反挥活性。KCL有利于引物与模板退火.高于50mmol/L 的KCL, 或50mmol/L 的NaCl对Taq DNA聚合酶有抵制作用。2、 Mg2 : 在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200μmol/L 时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。注意Mg2 与dNTPs之间的浓度关系，由于dNTP与Taq酶竟争Mg2 ，当dNTP浓度达到1 mmol/L时会抑制Taq酶的活性。 Mg2 能影响反应的特异性和产率。g2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。。此外，Mg2+浓度还影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度、产物的特异性、引物二聚体的生成等。由于 PCR反应体系中的DNA模板、引物和dNTP磷酸基团均可与Mg2+结合从而降低Mg2+的实际浓度。Taq DNA聚合酶在合成新DNA链时,要求有游离的Mg2+,因而在PCR系统中确定Mg2+的最适浓度是必要的，故常需根据各自的实验预先试验,以确定本实验的最佳Mg2+浓度,保证DNA聚合酶具有良好的活性。通常Mg2+的总量应比dNTP的浓度高0.2－2.5mmol/L。对于一种新的PCR反应, 可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+ 进行预备实验,选出最适的Mg2+浓度。3、 Taq酶保护剂：一般用乙酰化的BSA（小牛血清白蛋白100μg/ml），起着减少PCR管对Taq酶的吸附作用，稳定酶活性及保护作用。或者改为 5mmol/L的二硫苏糖醇(DDT)。另外加入T4噬菌体的基因32蛋白对扩增较长的DNA片段有利。保护剂还有明胶(0.01%)和Tween- 20(0.05%~0.1%)。4、三磷酸脱氧核苷酸（dNTPs）：dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，一般存储浓度为 10 mmol/L，小量分装， -20℃冰冻保存。经过两次冷冻-加热循环，会使dNTP降解，储存液就必须丢弃。若长期在-20℃下冻存，储存液中的少量的水分会蒸