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荧光定量PCR技术服务流程 引物和探针的设计 公司专利的Beacon技术（针对microRNA的检测）。 将mRNA序列转换成DNA序列。取3’末端5～6个碱基的区域，使之退火温度达到16℃（按照A、T=2℃;C、G=4℃的原则计算）。并用oligo 6 写出mRNA的反向互补序列。（方法：将序列粘贴至oligo 6，用“Change”选项中的“Strands”。） 正向引物的设计： 先根据mRNA的部分序列设计正向引物，长度为15个碱基左右序列与mRNA一致，5’端与mRNA的5’端起始碱基一致，使当前引物退火温度达到40～42℃，在引物的5’末端添加碱基，最终使引物退火温度达到56℃左右，计算原则同上。引物总长尽量短。 注意：检查正向引物自身形成的二聚体。3’端互补不超过3个碱基。 Beacon探针的设计： 将mRNA反向互补序列的16℃部分连同后面的2～3个碱基（注意：这2～3个碱基与正向引物的重叠不超过三个碱基。）复制下来，然后在此序列前后部分别添加相应的互补序列，作为“茎环结构”中的“茎”部分，此结构必须严格配对，目前通用序列为cGCagg和cctgCg，可供参考。在序列和前半部分的茎序列之间应添加若干碱基，使Beacon探针的退火温度达到60℃左右。当然也可在此序列后部和后半半部分的茎序列之间添加，但要注意和正向引物的重叠。 注意：用oligo 6软件不时的检查茎环结构是否存在，以及此探针和已设计完的正向引物之间的二聚体情况。 茎环结构逆转录引物的设计： 用Beacon探针的前部茎环节构序列参与“茎”的部分，即GgcCcTG和GCCAGCG。然后在反向引物和探针序列之间添加2～3个碱基，长度在40个碱基左右。目前通用序列为： GgcCcTGacaTCaGATGTgTtgGCTatacG＋探针除了后半部分“茎”序列的部分，可供参考。 注意：需检查所设计引物的结构情况。 反向引物的设计： 在上述茎环节构逆转录引物前端取20个碱基左右的序列，作为反向引物的序列，退火温度在54~56℃。例如：caTCaGATGTgTtgGCTa，可供参考。 注意：设计完成之后，检查其自身互补、与正向引物和Beacon探针的互补情况。 普通引物的设计（针对待检基因） 搜索基因相关信息 根据客户所提供的基因编号，在NCBI上查出该基因的相关信息，以文本的形式先保存下来。 运用oligo 6设计相应的引物 在上述从NCBI上摘录的信息中找到该基因的编码区位置，即“CDS”这一部分的序列，将其复制下来，打开oligo 6 把复制的序列粘贴上去，并“Accept”。点击“Change”菜单选中第一项“Current Oligo Length”，设定其长度为20个碱基。然后选择“Search”选项的第一项“For Primers and Probes”，在弹出的对话框中选中“Search Ranges”，把PCR产物的大小设为100～150个碱基，最后点击“OK”开始搜索。 c. 选择适当的引物 一般应选择该序列中后部的引物，尽量靠近后部，再用“Analyze”选项里的“Duplex Formation”分析正向引物之间、反向引物之间以及正反向引物之间的二聚体形成情况，引物3’末端互补的碱基不超过3个。 二. 客户样品 组织或细胞样品 a. 收到样品后立即置于-80℃冰箱冷冻保存。等到用时再取出，操作时尽量缩短样品暴露在室温状态下的时间。 b. Total RNA抽提： 往离心管中加入500ul Ezol，匀浆（如样品为细胞，则不需匀浆，直接加1ml Ezol至离心管中）。 称取适量的组织样品（一般为10～20mg左右，细胞样品则不需要称重。） 于2ml离心管中。 匀浆后补加500ul Ezol，将离心管上下颠倒混匀，室温放置10min。 加入200ul RNA专用的三氯甲烷，上下颠倒混匀，直至离心管中的液体彻底混匀，成乳白色状。 室温放置5min，12000rpm/min离心15min。 小心将上清转移至另一干净的1.5ml离心管中，切勿吸动中层蛋白相和下层有机相。 往上清中加入500ul预冷的RNA专用的异丙醇，室温放置5min。10000rpm/min离心10min。 小心弃尽上清，加入1ml RNA专用的75％的乙醇洗涤沉淀，10000rpm/min离心10min。 小心弃尽上清，置于室温晾干乙醇，加入适量的DEPC水溶解，混匀。 注意：上述步骤中所用离心管均经DEPC水处理。试剂均为RNA专用试剂。抽提人员需带上手套和口罩。用移液器吸上清时枪头切勿触碰RNA沉淀所在的一侧管壁。 c. RNA电泳： 将按上述步骤抽提的total RNA 取适量的体积进行1％琼脂糖凝胶电泳。分析结果，评价抽提质量。 注意：完整的