荧光标记PCR.docVIP

主要需要考察的方面： 加热方式 升降温速度 准确性 均一性 激发光源 检测元件 检测通路 监测系统 详情请参考全文…… 回顾分子生物学的发展历程，PCR技术的发明和普及无疑是最重要的篇章之一。而PCR技术在近20年的不断发展创新中，最受瞩目当属荧光实时定量PCR技术(real-time quantitative PCR, or qPCR)。定量PCR技术真正实现了PCR从定性到定量的飞跃，通过对PCR过程的实时监控，专一、灵敏快速、可重复地精确定量起始模版浓度，已经在科研和临床诊断领域得到了越来越广泛的应用。本文从荧光定量PCR的原理入手，详细介绍荧光定量PCR仪的类型和技术，为定量PCR仪的选择提供详细参考。 一、背景 本来，PCR是为了将样本中微量的DNA模版放大以便研究模版特性，随着研究的深入，要了解样本中基因的表达模式与疾病的关系，就需要了解标本中的DNA原始拷贝数。理论上PCR过程中反应产物是以指数规模增长的，但实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S形曲线——因为随着PCR循环数的增加，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐不敷需求，PCR的效率降低，产物生成的速度逐渐减缓，最终进入平台期。由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR反应体系进入平台期的时间和平台期的高低都有很大变化，即使是重复实验，各种条件基本一致，最后得到的DNA拷贝数也往往不同。因此经过PCR扩增的DNA产物量不能反映起始模板量的真实情况。通过传统凝胶电泳EB染色或者同位素标记只能定量PCR的终产物量，而不能定量起始DNA模版的拷贝数。 荧光实时定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面可以在每次PCR循环收集数据，建立实时扩增曲线，准确地确定域值循环数(CT值)，计算起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量。根据最终得到的数据不同，定量PCR可以分为相对定量和绝对定量两种。相对定量常见于比较两个样本中基因表达水平的高低变化，得到的结果是百分比；绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷贝数或浓度。 荧光实时定量PCR技术最早是在1992年由一位日本人Higuchi第一次报告提出的，他当时的初衷很简单，就是想实时地看到PCR反应的整个过程，由于当时EB（溴化乙锭）的广泛使用，最直接想到的标记染料就是EB，可以插入到双链核酸中受激发光。这样，在普通PCR仪的基础上再配备一个激发和检测的装置，第一台可实时监测的PCR仪就诞生了。在PCR反应的退火或延伸时检测掺入到双链核酸中EB的含量就能实时监控PCR反应的进程，考虑到PCR反应的数学函数关系，结合相应的算法，通过加入标准品的方法，就可以定量待测样品中的目标基因。定量PCR技术的提出不单是PCR技术的飞跃，也DNA定量技术的一次飞跃。经过不断发展完善，到1996年当时的PE公司（后来的ABI）推出了世界第一台商品化的荧光定量PCR仪，标记方法也由最初的染料法，逐渐发展到了特异性更高的Taqman探针法，以及Molecular Beacon、Fret等不同方法的标记探针。由于ABI公司在PCR领域的领袖地位和推动定量PCR技术的早期发展的特殊贡献， Taqman探针法得到广泛使用。 二、常用荧光标记方法 常用的荧光标记方法可简单分为两大类：1.非特异检测——双链dna内插式荧光染料；2.扩增序列专一检测——主要指荧光探针和引物探针。荧光染料技术成本低廉，实验设计简便；而探针杂交技术在原理上严格，所得数据特异性高、更为精确。在选择实验方案时要根据实验目的和对数据精度的要求来决定。 非特异性检测扩增序列的代表是SYBR Green I荧光染料。SYBR Green I只与DNA双链结合，插入DNA双链时发出荧光；DNA双链解链时释放出来，荧光信号急剧减弱。在一个加入过量SYBR green 1荧光染料的体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数量。SYBR Green荧光染料法定量PCR的基本过程是：1、开始反应，当SYBR Green染料与DNA双链结合时发出荧光。2、DNA变性时，SYBR Green染料释放出来，荧光急剧减少。3、在聚合延伸完成后，SYBR Green染料与双链产物结合，定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。SYBR Green I 的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。 荧光染料的优势在于能监测各种双链DNA序列的扩增，无需设计探针，检测简单简便，成本低廉。然而正是由于荧光染料能和任何dsDNA结合，对DNA模板没有选择性，因此它也能与