新型荧光探针1%2c3%2c5%2c7-四甲基-2%2c6-二甲酰乙酯-8-(3%27%2c4%27-二氨基苯)-二氟化硼-二吡咯甲烷在HPLC研究PC12细胞内NO释放中应用.pdfVIP

新型荧光探针1,3,5,7一四甲基一2,6一二甲酞乙醋_8_(3,,4, 一二氨基苯)一二氟化硼一二毗咯甲烷在HPLC研究PC12细胞内 NO释放中的应用 黄克靖王红张华山’ 武汉大学化学与分子科学学院，武汉，430072,hszhang@uvhu.edu.cn 一氧化氮((NO)是细胞内一种重要的信号分子，它参与血管调节、神经传递、炎症发生与 免疫反应等过程，分布遍及脑、血管、肺等多种器官。很多疾病如高血压、关节炎、老年性 痴呆等都与一氧化氮在生物体内代谢异常有关。因此，对生物体内一氧化氮释放的研究是至 关重要的。但是NO具有不稳定性和短的半衰期(30s)，所以很难直接检测。芳香邻二氨基类 化合物因对NO具有高的反应专一性和高灵敏度而被广泛应用于细胞中NO释放量的检测。该类 试剂主要有2,3一二氨基蔡(DAN),3,4一二氨基荧光素(DAF)以及3,4一二氨基罗丹明 (DAR)。但’DAN波长较短，DAR荧光量子产率低，DAF受pH影响较大，而且在光照下荧光 强度大大减弱，这些都限制了它们的应用。我们合成的新型3,4一二氨基BODIPY类试剂1,3, 5,7一四甲基一2,6一二甲酞乙酷-8-(3,4一二氨基苯)一二氟化硼一二毗咯甲烷 (TMDCDABODIPY)具有光稳定性好，本身荧光比较弱 (D(n=0.002)，在中性或弱碱性条件 下与NO反应生成强荧光的三氮哇TMDCDABODIPYT(Of,=0.56),，是一种荧光增强反应， 大大提高了检测灵敏度。同时其激发和发射波长较长 (X..=500nro,Xe:510nro)，因而不受 生物样品中内源荧光的干扰，非常适合用于生物活体和细胞中NO的检测研究。该试剂的结构 式及其与NO的反应原理见图10 C2Hs02C Fig.1.ReactionofTMDCDBODIPYwithNO 我们以TMDCDABODIPY为衍生试剂实现了PC12细胞释放NO的荧光造影分析。从荧光 造影图可以看出，加入反应底物 L一精氨酸后，细胞变亮。表明该衍生试剂可以很容易地透过 细胞膜，并能迅速捕获细胞释放的NO，生成强荧光的三氮哇。14分钟后，细胞达到了最亮， 这是因为细胞中L-精氨酸已经被消耗完全，不再有NO释放出来。 将此时的细胞破膜，离心后取上层清液，利用高效液相色谱分析细胞中生成三氮哇的含 量，间接检测NO的释放量。由于细胞之间存在较大的个体差异，为了反映细胞释放NO的差异 805 性，必须对尽可能少的细胞的NO释放量进行测定。因此我们用四氯化碳为萃取剂结合超声辅 助技术萃取三氮哇，萃取物用反相高效液相色谱分离荧光检测。高效液相色谱分离的条件为: 流动相为甲醇 (加50mM乙醇胺)，柱温为30C，流速为1mL/min,荧光检测激发波长为500nm, 发射波长为510nm。在此优化条件下，在4分钟内实现了试剂峰和衍生峰的分离。NO浓度在 9X10--2.5X10mol/L范围内有良好的线性关系，检出限为5X103mol/L(S/N二3).用该 方法洲门成功地实现了200个细胞在14分钟内NO释放量的测定，结果如如图2所示。 闷州.，..叫.- ，~州，一 ，..甲..，.曰， 曰...~..- r ~， 一 心 Fig.2.Detectionoftriazoleformationusingreversed-phaseHPLC.Themobilephasewasmethanol containing50mmol/Lethanolamine,anddeliveredbyanHPLCpumpataflowrateof1.0ml/min. Thecolumntemperature.was300C.Theexcitationwavelengthwas500nn andtheemission wavelengthwas510nm.(A:StandardTMDCDABODIPYandTMDCDABODIPYT.B:200 PC12cells;a:TMDCDABODIPYT.b:TMDCDABODIPY). 关键词:1,3,5,7一四甲基一2,6