重组人白细胞介素—６发酵条件研究和代谢通量模型的建立.pdfVIP

重组人白细胞介素一6发酵条件研究及代谢通量模型的建立’ 孙博智甘一如赵学明 (天津大学化工学院生物化工系 天津300072) 关键词 白细胞介素一6重组犬肪杆菌代谢漉分析 人白细胞介素-6(Hil-6)是～种具有复杂生物功能的细胞因子，在机体免疫应答、骨髓造 血和抗肿瘤方面均有重要作用，在临床上有着广泛应用前景。传统上较优的发酵条件只有通过 大量的实验得到，由于缺乏对发酵菌体内部代谢机理的认识阻碍了生产能力的进一步提高。近 年来发展起来的代谢通量分析理论，通过对细胞内部生化反应速率的分析找出影响生产的关键 因素．为基因工程改造菌体及优能发酵条件提供指导。本文研究了重组人白细胞介素_6的发酵 条件，并初步建立了代谢通量分析模型以期能更好的指导实际的发酵生产。 7 1材料与方法 1 ) ，r 1．1菌种和培养基 ! e d． ． ㈠，，． 宿主菌：E．coliPOP2136，质粒：PKPL3A由北京医科大学分子免疫室提供。 LB培养基：胰蛋白胨109佴，酵母提取物159几，NaCl109／L,调pH到7．0，灭菌后加入 ’ 氨苄青霉素钠0．tg／L。 { 39／L，Na2HPO。 优化培养基[41：葡萄糖5．Sg／L。胰蛋白胨0．Sg／L，酵母提取物O．89／L，NaCl 13．og／L，KH：P04 6．59／L，调pH到7．0，灭菌后加入氨苄青霉素钠0．19／L。 1．2培养方法 I 1 。 1．3分析方法 。 ， 菌体密度：铡定600rim波长处的光密度OD‰。 量。葡萄耱浓度：3，5一二硝基看辛畅酸比色法。。 2发酵条件的研究 2．1无机盐对人自介素一6表达的影响 ；， 2．1．1 NH∞l浓度的影响无机盐NHcl作为一种速效氮源在比生长速率较低时易于为菌体利 用，而在高比生长速率时利用量则较少。实验考察了NH4Cl浓度对菌体生长及人白介素一6表达 的影响。如图1所示lg／L左右的NH．CI可以提高菌体密度，但NH．CI浓度再提高对菌体密度的 影响则不大。当NH．C1浓度小于49／L时人白介素一6的表达量可以维持在较高的水平上，NH4CI 浓度高于+g／L后，自介素-6的表达量明显降低。因而，培养基中加入较低浓度的NH。CI比较合适。 2．1．2 Nacl浓度的影响NaCI主要用于调节培养基的渗透压，菌体只有在一定的渗透压范围内 才能正常的生长，而适宜基因工程菌生长及产物表达的渗透压范围则更小，因而采用合适的渗 国家自然科学基金资助项目及国家“九五”攻关项目(96-C03．01-02)． 住2 透压对目标蛋白的生产十分必要。保持优化培养基中其他营养物浓度不变，改变NaCI的浓度， 结果如图2所示，当NaCI浓度小于109／L时，菌体密度及白介素一6的表达量都能维持在较高水 平：而当NaCI浓度超过109／L时，菌体密度及白介素一6的表达量都明显下降。 l 4 30 L6 l 2