二茂铁标记DNA电化学探针的研制和性质研究.pdfVIP

坌堑垡兰箜壁塾皇垫些 ——一 二茂铁标记DNA电化学探针的研制及性质研究 何品刚 榇春蔡宏 方禹之 (华东师范大学化学系上海200062) 关建词二茂铁DNA标记 核酸的分子杂交技术是解决核酸的结构分析和测试这一问题的重要手段。传统的标记方法 存在检测能力不够，标记方法过于繁杂，使用放射性物质造成污染或者设各昂贵等弊端。本文咀 L基-(3-二甲基丙基)碳g--亚胺盐酸盐(EDC)为偶联活化剂，利用氨醛缩台反应，分别将电化 在变性天然小牛胸腺DNA片段上，制各成二茂铁标记DNA电化学探针。采用电化学、红外等 方法研究了二茂铁标记DNA探针的性质。实验结果表明，该二茂铁标记DNA电化学探针制备 方法快速、简便、标记的效率高．重现性好．寿命长。为将二茂铁标记DNA电化学探针应用于 特定序列DNA片断的识别、检测和DNA的损伤与保护的研究奠定了坚实的基础。 1二茂铁标记DNA电化学操针的制备 往眯唑缓冲溶液加^变性小牛胸腺DNA使DNA上的磷酸基活化。对于氨基二茂铁，在偶 联活化剂EDC的存在下直接加入氨基二茂铁；对于醛基二茂铁，先加入乙二胺使DNA上经活 h，从 化的磷酸基与乙二胺连接后．再在EDC的存在下加入醛基二茂铁。25℃均匀搅拌反应l 而在寡聚DNA片段上标记上电活性物质二茂铁。然后向反应溶液中加^体积比为20：1的无水乙 醇和醋酸缓冲溶液(pH-5．2)，放入冰箱冷冻后取出，经静厶分离得少量沉淀即为二茂铁标记DNA 探针。 2二茂铁标记DNA电化学探针在石墨电极E的电化学响应 有文隹H。1报道．DNA片段5’端上的磷酸基在EDC的存在下可以与氨基以磷酸氨基酯键形式 结台。我们曾用该反应将单链DNA固定在导八氨基后的石墨电极上田。对于氨基二茂铁．是其 结构中的氨基与DNA片段上的磷酸基在EDC的作用下生成磷酸氨基酯键。对于醛基二茂铁， 则是醛基二茂铁上的醛基与变性小牛胸腺DNA上导入的氨基在EI)C的作用下的缩台反应。用 石墨电极在TE缓冲溶液中记录氨基二茂铁标记DNA电化学探针和醛基二茂铁标记DNA电化 v～+0．50 学探针在0．0 v范围内的差分脉冲伏安(DPV)曲线。图1a和图lb分别为氨基二茂铁 标记和醛基=茂铁标记DNA电化学探针在石墨电极上的电化学响应图。从图中可以看至Ⅱ，二者 在+0．25 V附近均出现氧化峰，峰电流分别为7．0“A，6．0肚。这说明弦们制各的二茂铁标记DNA 电化学探针在石墨电极上有良好的电化学响应。 3二茂铁标记DNA电化学探针的红外光谱研究 将制备好的二茂铁标记ⅨqA电化学探针与KBr粉末碾磨均匀压片制成样品KSr片．应用 000cnl-1。图2为二茂铁标记DNA Nicolet5SxcFT-IR红外光谱仪进行扫描，波数范围为00TI-1～2 电化学探针的红外光谱图(以氨基二茂铁标记DNA探针为例)。图中出现明显的DNA与二茂铁 095cm。1和】230 的特征吸收蜂，在l cm-1处出现磷酸根的对称伸缩振动和反对称伸缩振动，在 1540 660 409 Cm-1和lcm～1处出现核酸骨架和碱基上的C=O的伸缩振动【∞：在lCm-‘处出现茂 457 548 环上C-C的对称伸缩振动，在l cm-1和1clrl．i-1处分别出现茂环上C-C的反对称伸缩振 分析化学的成就与挑战 动和C-N的对称伸缩振动[41。说明氨基二茂铁被成功地标记在DNA链上。 参考文献 I C,oodfriendTLLevineLFammnGnScience,1964，144：1344 2 Acids 3 GhoshS MtmsoGENucleic S R％，1987,15：5353