碱性污染土壤宏基因组文库的构建以与酶基因的克隆.pdfVIP

100 2007年中国微生物学会学术年会 温和气单胞菌等均具有明显的裂解作用，但均不能裂解所试的革兰氏阳性菌(金黄色 葡萄球菌、藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌)和酵母菌(酿酒酵母和白色假丝酵母)，对鳗弧 菌、创伤弧菌和大肠杆菌的裂解则表现明显的差异性。基于各类型代表性菌株和已知 所有模式BALOs菌株近全长16SrRNA基因序列的系统发育关系及形态和生长特性 四个“种”，其中仅c型菌株可归为已知的“海岸噬细菌”(Bacteriovorax litoralis)。菌株 DA5在通气条件下对共培养的溶藻弧菌有明显的清除作用，较短时间(1d)内可使寄主 菌数量下降2—3个数量级，但长时间(30d)共培养也不能完全清除寄主细菌；室内小 规模试验表明，与对照组相比，水体中不同含量(103—105pfu／m1)的DA5细胞对凡纳滨 对虾幼体弧菌病均具有较显著的防治效果。 温崇庆 男，汉族，1974年9月出生，安徽名郎溪县人，广东海洋大学讲师，中山大 学在职博士研究生，目前主要从事海洋和水产微生物学的教学和科研工作。 1993年9月～1995年7月安徽农业大学生物工程系应用微生物学专业大学专 科学习； 1995年8月一1998年8月安徽省郎溪县酒厂工作； 1998年9月一2001年7月安徽农业大学生物工程系生物物理学专业硕士研究 生学习； 2001年7月一至今广东海洋大学水产学院海洋和水产微生物学的教学和科研工 作； 2004年9月一至今中山大学生命科学学院海洋生物学专业博士研究生学习(导 师周世宁教授)。 碱性污染土壤宏基因组文库的 构建以及酶基因的克隆 蒋承建胡婷婷武波 (广西大学微生物及植物遗传工程教育部重点实验室； 广西亚热带资源保护利用重点实验室，南宁，530005) 极端微生物是一个巨大的潜在的优势基因资源库，未培养微生物研究是极端微生 物研究的一个重要组成部分。未培养微生物在自然界土壤栖息群中占99％以上的资 2007年中国微生物学会学术年会 10l 源。直接从极端环境土壤中抽提纯化宏基因组DNA构建文库是从分子生物学角度研 究微生物基因资源的重要途径，这也是研究未培养微生物的生态、生理等特性的关键方 法。本研究工作从碱性污染环境中采集土壤，直接提取纯化土壤宏基因组DNA，利用 大肠杆菌作为宿主细胞构建质粒宏基因组文库。直接抽提和分离得粗制宏基因组 DNA的产量为每克土壤样品10—301山g。经过纯化后采用限制性内切酶EcoRI酶部分 酶切处理，构建了以pGEM一3Zf(+)为载体的DNA部分文库。该文库随机插人载体 的外源DNA片段平均大小为3．5kb左右，DNA文库的总容量为75．68MB。建库效率 为从每克环境样品中获得6，000个左右的含随机外源DNA片段插入载体的克隆。 采用基因的直接测序筛选策略分离得到了一种新型的L一半胱氨酸脱羧酶。编码 新型L一半胱氨酸脱羧酶的基因被命名为undeclA，该基因由1077个核苷酸序列构成， 编码由359个氨基酸组成的大小为38kDa的蛋白质。该酶与来自Porphyromonasgingi— valis W83的一种磷酸式泛酰巯基乙胺半胱氨酸脱羧酶有56％的相似性。UndeclA氨 基酸序列的分析比较揭示了UndeclA蛋白和属于HFCD家族的蛋白具有相似的黄素 蛋白结合模式，保守的活性位点和半胱氨酸脱羧酶残基位点，因此，我们将UndeclA蛋 白鉴定为HFCD蛋白家族的新成员。我们进一步在大肠杆菌系统中过量表达了un— Chroma— declA蛋白并最终纯化出了目标蛋白并进行了深人的酶学性质研究。Liquid tography—MassSpectrometry实验结果证实了L一半胱氨酸在UndeclA蛋白作用下脱 羧后形成了脱羧产物半胱胺。该酶的最佳作用温度为35℃，最佳作用pH值为7．O。 进一步的研究显示，UndeclA蛋白具有明显的HFCD蛋白家族底物结合簇序列特征。 将UndeclA的His一30突变成Asn将导致整个基因的失活；