介观流控系统中激光诱导荧光测定DNA地研究.pdfVIP

2005年 10月 第三届全国徽全分析系统学术会议论文集 湖北武汉 介观流控系统中激光诱导荧光测定DNA的研究 陈旭伟，王建华’，方肇伦 (东北大学分析科学研究中心，沈阳 110004 摘要:以澳化乙锭为荧光探针，建立了阀上实验室一介观流控系统激光诱导荧光分析dsDNA的方法. 进样ti600n1，线性范围为0.03-3.0pg.ml-，检出限为0.009gg.ml-,RSD1.9%，分析频率为60h-. 合成样品回收率为95.6-103.4%，对质粒DNA的分析结果与标示f相符. 关健词:介观流控系统;阀上实验室;dsDNA;激光诱导荧光;澳化乙锭 微量DNA的定量分析在生物学和医学中具有重要意义。在常见分析方法中，荧光法灵敏度高， 抗干扰能力强而备受关注。常用于DNA荧光分析的探针包括澳化乙锭(EB)Il,hoechstil,PicoGreen131 等。但这些荧光探针一般都比较昂贵，手工操作耗样量大，分析成本高。 介观流控分析系统14)以阀上实验室((LOV)为核心，可在0.1-10川水平上精确控制流控操作，且集 成在阀上的多功能流通池适合于吸收和发射光谱的实时原位测定IS) 本文以473nm激光为激发光源，EB为荧光探针，在阀上实验室中实时铡定微量dsDNA，单次 测定仅消耗600n1样品和1.0川EB溶液，显著提高了分析速度，降低了分析成本。 1实验部分 1.1主要试剂和仪器 X-DNA/HindIII(洛阳华美生物有限公司);EB (美国生命科学公司);Tris(国药集团化学试 剂有限公司);EDTA(沈阳试剂厂)。 PMTFL荧光计(Oceanoptics);FIAIab3000顺序 注射系统(FIAIabInstruments),MBL-11型激光器(长 春新产业光电技术有限公司)。 1.2实验流路 如图1所示。 Fig.)TheflowmanifoldofLOVmeso-fluidic systemforDNAquantification 1.3实验流程: 按图l所示依次吸入载液、EB和样品溶液，在发射波长610nm处测定EB与DNA混合前后 的荧光强度变化，以荧光强度的增里与DNA浓度的关系为定量依据。 2结果与讨论 2.1实验条件的选择 2.1.1缓冲溶液:以TE(10mMTris,1.0mMEDTA)为缓冲介质，所采用的酸度为pH8.5. 2.1.2EB浓度和用量:EB自身发射荧光，其浓度和用童须严格控制。本文经优化后选择其浓度和 用A分别为2.0gg.ml，和1.0ale 2.1.3流速和停流时间:样品塞向流通池中转移的流速大于0.5泌s时，荧光强度的增量随流速增 通讯联系人:王建华 基金项 目:国家自然科学基金 (No 毛牡 2005*10A二__二_二_一一一」 1}}.lIk3E5?8r7f}}}渔!i9tQ 一一一一一一一 大呈下降趋势，本文选择0.5gl.s.在此流速下，停流对灵敏度影响不大，故无需停流. 3分析性能 3.1线性范围、检出限和精密度 在0.03-3.0ltg.ml范围内，DNA浓度与荧光强度增里呈线性关系，进样600n1时回归方程为: A1=9386.6CGNA-787.96。检出限为0.009N.g.ml:相对标准偏差为1.9%(1.0gg.ml)o 若保持其他条件不变，在一定范围内增加进样量还可进一步降低检出限。如进样量增加为2.0川 时，可将检出限降低到0.006gg.mlo 3.2干扰实验 DNA浓度为1.0Ljg.ml，在士5%误差范围内，生物样品中常见的金属离子对测定不产生干扰， 其他物质的允许量为:蛋白质 (0.2%,m/v);SDS(0.01%,m/v);Trim X-100(0.1%,v/v);苯酚 (0.1%, v/v);GuHCI(0.5%,m/v);氛仿 (2.0%,v/v);EDTA(20mM)o 3.3样品测定 测定了合成样品及质粒DNA提取液中的DNA含量，结果如表1