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实验十 水的卫生细菌学检验（综合） 水中大肠菌群数的测定 一、目的要求 学习大肠菌群数的检测原理和方法。 二、实验材料 样品：水样 2. 培养基：乳糖胆盐发酵管(单料及双料)，伊红美兰琼脂(EMB)平板，乳糖发酵管。 3. 其他：显微镜，酒精灯，无菌吸管(10m1、1m1)，接种环，载玻片等 三、基本原理 水中的病原菌多数来源于病人和病畜的粪便。由于病原菌的数量少，检测过程复杂，因此，直接测它们的存在是非常困难的专业化工作。由于大肠菌群在粪便中数量大，在体外存活时间与肠道致病菌相近，且检验方法比较简便，因此一般采用测定大肠菌群或大肠杆菌的数量来作为水被粪便污染的标志。如果水中大肠菌群的菌数超过一定的数量，则说明此水已被粪便污染，并有可能含有病原菌。 大肠菌群的定义是指一群好氧和兼性厌氧、革兰氏阴性、无芽孢的杆状细菌，并能在乳糖培养基中，经37℃24~48h培养能产酸产气。我国规定每升自来水中大肠菌群不得超过3个。检测大肠菌群的方法有稀释培养法和膜滤法两种，其中稀释培养法是标准分析法，为我国大多数卫生单位和水厂所使用。它包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。 四、方法与步骤 采样：取100ml磨口带塞玻璃瓶，包扎后，干热灭菌备用。 取自来水样时，至少应先放水5min，以冲去龙头口所带的微生物，获得主流管中有代表性的水样。取样时，用右手握瓶，左手启开瓶塞，用覆盖瓶口的纸托住瓶塞，收集样品后，连同覆盖纸一起将瓶口塞好，并用线绳在原处扎好。注意手指不得触及瓶口内部。在静水中取样时，先用右手揭去塞子，瓶口朝下浸入水下约30cm处，然后将瓶子反转过来，待水注满后，取出塞好瓶口。如果水在流动，瓶口必须迎着水流，以免手上的细菌被水冲进瓶子。 水样放置过程中，内含的细菌数目和类型会发生变化，所以要求水样品应于6~10℃贮存，并不超过6h。 初发酵试验：吸取待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，10ml接种量采用双料发酵管，而lml及lml以下接种量采用单料管。每一接种量接种3管，置于35~37℃培养24士2h。将产酸、产气的发酵管按下列程序继续进行检验。 在指示性培养基上分离培养：将产气的发酵管中的发酵液在EMB平板或远藤氏平板上划线分离，置于35~37C培养18~24h。 革兰氏染色及镜检：于上述平板上长出的菌落中挑取1~2个大肠菌群可疑菌落进行镜检和革兰氏染色。 复发酵试验：将上述镜检之菌落同时接种于乳糖发酵管，置于35~37C培养24土2h，观察产气情况。 结果：凡是在乳糖胆盐发酵管产酸、产气，在指示性培养基上能生长的，革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，在复发酵管中产酸、产气的，即说明有大肠菌群的细菌存在—大肠菌群阳性；有一项不符的，即说明无大肠菌群的细菌存在—大肠菌群阴性。 根据有大肠杆菌细菌存在的初发酵管的管数，查相应的大肠杆菌检索表，报告每100毫升待检样品中大肠菌群细菌的最近似数。 五、实验报告 根据上述方法及步骤检查所给水样中大肠菌群细菌的含量。 测定水中大肠菌群数有什么实际意义？为什么选用大肠菌群作为水的卫生指标？ 采 样 稀 释 初发酵：乳糖胆盐发酵管，35~37℃ 18~24h 不产酸 产 酸 结论：大肠菌群阴性 EMB平板，35~37℃ 18~24h 革兰氏染色 乳糖发酵管，35~37℃ 24±2h 革兰氏阳性 革兰氏阴性，无芽孢杆菌 产 酸 不产酸 结论：大肠菌群阴性 结论：大肠菌群阳性 结论：大肠菌群阴性 图5-1 大肠菌群的检验程序 大肠菌群最可能数（MPN）检索表 阳性管数 MPN 阳性管数 MPN 1ml×3 0.1ml×3 0.01ml×3 个/dL 1ml×3 0.1ml×3 0.01ml×3 个/dL 0 0 0 ＜30 2 0 0 90 0 0 1 30 2 0 1 140 0 0 2 60 2 0 2 200 0 0 3 90 2 0 3 260 0 1 0 30 2 1 0 150 0 1 1 60 2 1 1 200 0 1 2 90 2 1 2 270 0 1 3 120 2 1 3 340 0 2 0 60 2 2 0 210 0 2 1 90 2 2 1 280 0 2 2 120 2 2 2 350 0 2 3 160 2 2 3 420 0 3 0 90 2 3 0 290 0 3 1 120 2 3 1 360 0 3 2 160 2 3 2 440 0 3 3 190 2 3 3 5