MG-S6株MGA0553基因功能研究初探.pdfVIP

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会 MG．S6株MGA0553基因的功能研究初探 高继业1jT铲”高勤擘2陈鸿军。 (1中国农科院上海善区研究所。上海，2∞232；2_；王券省畜牧善医职业技术学院，江苏泰州．225300： ’拓州大学善匮擘庞，江苏扬州。225009) M础印daⅢ全基因组测序工作的顺利完成吸引了无数生命科学的研究者对其致病机 理以及分子生物学方面进行深入研究。由于基因组的“衰减性”进化使得MG生物合成及代谢 能力受至Ⅱ很大的限制，许多功能蛋自酶、膜相关蛋白、致病因子的分子结构都与别的原核生 物存在许多差别，有的缺少典型的功能结构区域，有的只具备蛋白功能结构基序，有的甚至 只含有与蛋白功能结构基序有一定同源性的结构，因此这给研究其编码基因的功能增加了难 度。为了初步鉴定MGA0553基因的功能。制备特异性抗体是十分必要的。本研究利用MG．S6 株作为对象，扩增与Rlow株MGA05s3基因具有高度同源性的片段，并将获得的基因片段 在Ec口矗BL2l(DE3)上进行原核表达。结果发现，表达产物形成难溶的包涵体；以表达产 物作为可溶性抗原，并采用切胶免疫的方式，免疫6周龄ICR小鼠，能够刺激机体产生特 异性抗体I用westeⅡ卜blot方法对细菌表达产物进行检测，结果表明：重组表达载体 式存在．该特异性抗体的获得为初步研究MGA0553的功能奠定了基础。 l材料和方法 1．1菌株 本室保存：S6株(由江苏省农科院邵国清老师惠赠)；ICR小鼠购自扬州大学实验动物中心。 1．2簸体与主要试剂 M甜k盯 回收uNA试剂盒购于德国01AGEN公司：B硎HI、跗I限制性核酸内切酶、DNA 全菌及培养物浓缩上清抗血清(自制)：MGA0553原核表达产物抗血清(见前一章)：羊抗 小鼠IgG荧光抗体、m乇P标记羊抗小鼠IgG酶标抗体购自CigIlla公司；酶联反应板：PBS、 甘油缓冲液自制；改良Frey‘s完全液体、固体培养基；NC膜、PBST’TBsT、封闭液 l-3重组表达质粒载体的构建及鉴定 1．3．1连接反应 按第一章方法用B跗lH1和salI将重组质粒DNA和pET-32a(+)原核表达载体进行 双酶切，经l％低熔点琼月＆糖凝胶电泳，用凝胶DNA回收试剂盒分别回收目的片段和载体 uL。 质粒DNA。按如下体系加入各反应成分进行连接反应，反应总体积10 1．3．2细苗转化 受态细胞，转化后涂布含Ampicill．n(Ioou咖L)的LB平板，37’C过夜培养(具体操作同 第一章细菌转化)。 1．3．3重组质粒提取和酶切鉴定 随机挑取单个散在白色菌落，接种于含Ampicilh(100u∥mL)的LB液体培养基中． I和订I限制 37℃200rpm振荡培养过夜，按小量碱裂解法提取重组质粒DNA，用且MH ·联系作者：丁铲(1962·)．舅，汉，江苏豢州人．研究员，博士．主要从事徽生物学研究． 109l 其他论文 性核酸内切酶对重组质粒进行双酶切鉴定有无插入片段及片段大小。 酶切结束后将产物用1％琼脂塘凝胶进行60v恒压电泳1．5h，在凝胶成像分析系统下观 察并拍照记录。 1．4MGA05∞的原核表达 1．4．1重组质粒在E∞盯BL21(DE3)中诱导表达条件的优化 mM mM 似昀ct、0．4％Gl”eml、17KH2P04、72K2HP04)培养基中，37℃、200rpm振荡培 Ih、2ll、3h、4h、5h、6h的菌液各lmL待用；同时设立空载体诱导对照组。． 两次彻底去除培养基成分。最后以50uLPBS重悬菌体，加入50uL2×上样缓冲液(O．5M pH 6．8Tris