一种新型非病毒纳米基因载体%3a多聚赖氨酸-硅纳米颗粒.pdfVIP

种新型的非病毒纳米基因载体：多聚赖氨酸一硅纳米颗粒 21l 一种新型的非病毒纳米基因载体：多聚赖氨酸一硅纳米颗粒 朱诗国 吕红斌向娟娟唐珂张必成用鸣李桂源 无论是在基因结构、功能与调节等基础研究方面，还是在疾病的治疗、预防，如基因治疗、 DNA疫苗等临床应用方面，DNA传递始终是一个强有力的普遍应用工具，而且也是其中的核 心技术。DNA传递的效率直接影响到其基础研究与临床应用的成效。传统的DNA传递系统 分为病毒载体介导系统和非病毒载体介导系统Ⅲ。病毒载体介导系统是迄今为止最有效的 DNA传递工具，其传递效率通常高达90％以上，最近临床基因治疗中75％应用病毒载体介导 系统。尽管如此，由于该系统存在的自身局限性，如病毒毒性与免疫原性，有限的DNA装载 量，载体组装难度太、花费高等，其应用受到很大限制，而且至今仍无明显证据证明其临床效 应oJ。所以非病毒载体介导系统逐渐成为研究的热点。非病毒载体介导系统虽无病毒毒性和 免疫原性等缺陷，但其传递效率一直不如病毒载体介导系统，如何提高非病毒载体介导系统的 传递效率于是成为热点中的瓶颈问题。近来，随着纳米生物技术的飞跃发展，以纳米颗粒为基 础的非病毒纳米基因载体系统的出现有望突破这一瓶颈”】，实现安全、高效和靶向性DNA传 递，为基因结构与功能研究及其临床应用创造最佳条件，提供最好工具。 以纳米颗粒为基础的非病毒纳米基因载体的研制在国际上已是愈演愈烈。既有用有机材 tic acid)”J等进行研究的；又有用无机材料，如烷化硅纳米颗粒”1等进行研究的。但同时应用 有机和无机材料进行复合纳米颗粒基因载体研究的却未见报道。为此，本研究首先应用微乳 液法合成硅纳米颗粒(silica sine—silica 步的细胞转染研究表明PLL—SiNP具有比脂质体更高的转染效率，是一种新型的非病毒纳米 基因载体。 材料与方法 (一)主要材料 PLL)，m黼，购自signm公司；绿色荧光蛋白(嚣re即fluorescent 一2购自CLOlgrECH公司；脂质体购自GIBCA)公司；HNEl细胞系由本室提供。 作者单位：41{1078长沙。中南大学湘雅医学院肿瘤研究所 212 中国I|If症研究进晨@ (二)鲫P的合成 OP一10、环己烷和氨水按一定比例混合，室温搅拌1h；加入适量TEOS，继续搅拌24h；加 000 人适量丙酮，超声分离2h；8 drain离心10rain；双蒸水洗涤数次，离心收集沉淀；80℃干燥； 研细，室温存贮备用。 (三)ILL—Sn盱的制备 ml moYL 0．6 rain；离 电子天平准确称取lnagSINP，重悬于1 Na2C03溶液中，超声分散15 ml 心，弃上清，重悬于l PBs(nH7．4)中，超声分散20min；加适量多聚赖氨酸，充分混匀，室温 混摇24h；离心，弃上清，沉淀重悬于适量双蒸水中，4℃贮存备用。 (四)SiNP及H工一SiNP电子显微镜检测 检测前一日准备干净的铜网，在铜网上制福尔马膜；将待检样品超声分散半小时后滴样于 已制膜的铜网上，自然干燥；透射电镜观察、照片。 (五)PLL—SiNP与DNA结合分析 h：①1％琼脂糖凝胶 50：1、100：1的比例混合，其中DNA浓度恒定为1rⅢJlOO“l，室温静置1 60 v电泳2h；②12000r／rain离心10rain，取上清液，紫外分光光度计检测DNA含量。 (六】DNaseI消化试验 U 50：1的比例混合，室温静置1h后各加0．5DNaseI，37℃水浴1h；1％琼脂糖凝胶电泳。 {七)细胞转染 清洗盖玻片，置95％乙醇中，火焰消毒，置六孔培养板中，接种