乙型肝炎病毒X蛋白对p53介导肝癌细胞凋亡影响.pdfVIP

中国癌症研究进展⑤ 乙型肝炎病毒x蛋白对p53介导的肝癌细胞凋亡的影响 郭双平王文亮 病毒和细胞凋亡的关系是近年来细胞凋亡的重要研究领域之一，已发现很多致瘤性DNA 病毒可编码蛋白促进或抑制细胞凋亡。这是病毒感染的需要。也是其致病性的表现。研究报道 与原发性肝癌密切相关}珥Ⅳx蛋白可促进肝癌细胞生长，增强其恶性表型，抑制肝癌细胞凋 亡L1．2J。X蛋白抑制肝癌细胞凋亡的机理目前尚不清楚，x蛋白可与细胞负性调控因子p53 而抑制p53介导的细胞凋亡，这可能是X蛋白抑制细胞凋亡的机理之一。为进一步研究X蛋 白与p53在肝癌细胞凋亡中的作用，我们采用基因共转染的方法，将HBVx基因和野生型p53 共转染人人HCC-9204肝癌细胞，阿霉素诱导细胞凋亡，检测细胞凋亡率，研究转染外源性 FIBV x基因后对wt-p53介导的肝癌细胞凋亡的影响，探讨x蛋白抑制细胞凋亡的机理。 材料和方法 (一)材料和试剂 人HOB9204肝癌细胞系为第四军医大学病理学教研室建株，病理诊断为肝细胞肝癌Ⅱ～Ⅲ 级。wt-p53．尸和HBV 品，地高辛DNA随机引物标记试剂盒，凋亡检测试剂盒购自德国宝灵曼公司，鼠抗p53单克 抗体、羊抗兔荧光抗体购自华美公司。 (二)方法 1．基因转染 000纯 (1)基因转染及检测：用碱裂解法提取质粒wt-p53．po‘“和po“·1。麟，聚乙二醇6 d。”·。““和2,ugwt．rd3一p倒质粒，然后与B液(100皿无血清培养液中含10t．d脂质体)混 H009204肝癌细胞。 (2)筛选：转染3 继续培养，同时设对照。对照组实验，用选择性培养液培养未进行基因转染的亲本细胞人 H009204肝癌细胞。 作者单位：710032西安，第四军医大学病理学教研室 乙型肝炎病毒x蛋白对西3介导的肝癌细胞揭亡的影响 181 KpnI双酶切pd’∞1’8质粒，以HBX片段作为探针，地高辛随机引物标记法标记。按常规 X p53．po和do∞·oo‘质粒的第四代肝癌细胞中I-iBVmRNA和po“DNAo设对照反应： 未转染基因的肝癌细胞为阴性对照，不加探针的为空白对照。 光抗体稀释度为1：35，缓冲甘油封片后，荧光显微镜下观察照相。 一 设对照实验：分别以PBS代替一抗或二抗为空白对照，以未进行基因转染的肝癌细胞为 。 阴性对照。 r‘‘ 2．转染—“艋1-H“质粒对p53介导的肝癌细胞凋亡的影响 (1)阿霉素诱导肝癌细胞凋亡：用20 p倒质粒及单独转染Wt．p53一p“质粒的第四代肝癌细胞凋亡。相同实验条件作用于共转染 空载体的肝癌细胞和未转染基因的亲本细胞HCC-9204。具体步骤同前。 (2)检测细胞凋亡：①透射电镜：收集离壁漂浮的细胞，制备透射电镜标本。②TUNEL法 tool／ 检测凋亡细胞：将生长在盖玻片上的细胞于4％多聚甲醛在室温下固定30rain；用0．01 l TUNEL 膜，避光，37℃，孵育60 PBS u洗3次，加50,；反应混合液，上覆盖一层npardilm耐 洗，缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察，照相。对照实验：未诱导