乙型肝炎病毒X蛋白和核转录因子NF-κB在肝癌细胞凋亡中的作用.pdfVIP

330 中国癌症研．兜进展@ 乙型肝炎病毒X蛋白与核转录因子 NF—KB在肝癌细胞凋亡中的作用 鄣双平王文亮翟宇强赵一岭 核转录因子NF—r．B是与细胞存活相关的基因，对细胞凋亡起抑制作用。核转录因子 NF—KB通常与其抑制物k瞻结合以非活性形式存在于细胞质中，只有在受到各种因素的激活 后，其抑制物IKRs被降解，核转录因子NF一曲被活化并从细胞质中转位于细胞核发挥作用， 文献报道乙型肝炎病毒x蛋白可激活核转录因子NF—KB【1]，使其转位于细胞核而发挥作用。 那么，乙型肝炎病毒X蛋白是否通过对核转录因子NF一加的活化而抑制肝癌细胞凋亡呢? 本研究首先研究了乙型肝炎病毒X蛋白与核转录因子NF—gB的关系，进一步探讨了乙型肝 炎病毒X蛋白与核转录因子NF一棚在肝癌细胞凋亡中的作用，应用特异的抑制剂ALLN阻断 察阿霉素诱导肝癌细胞凋亡率的变化，以阐明乙型肝炎病毒X蛋白与核转录因子NF一店的 相互关系及其在肝癌细胞凋亡中的作用。 材料和方法 (一)材料和试剂 人HCC一9204肝癌细胞系为第四军医大学病理学教研室建株，病理诊断为肝细胞肝癌 p65多克隆抗体购自SanmCam公司，AuN特异性抑制剂，凋 Ⅱ一Ⅲ级，主要试剂兔抗NF—xB Promega公司。 (=)基因转染及筛选 NA3．1质粒分别转染人HCC一9204肝癌细胞，HBVx基因真核表达载体为本室构建”1。基因 700 转染参照GIBCORL说明书进行。接种细胞于选择性培养液，培养液含G418pg，llll，培养1 周后换于含G418 500心血的培养液继续培养。同时设对照，用选择性培养液培养未进行基 因转染的亲本细胞。 (三)原位杂交检测基因转染肝癌细胞中IIBVx基因的表达 质粒的第四代肝癌细胞。对照实验：设未转染肝癌细胞为阴性对照，不加探针的空白对照。 (四)免疫荧光法检测肝癌细胞中x叠自 作者单位：710032西安，第四军医大学病理学教研室 乙型肝炎病毒x蛋白与核转录因子吓一曲狂肝癌细胞弼亡中的作用 331 达。对照实验：空白对照分别用PBS代替一抗或二抗。阴性对照为未进行基因转染的HCC一 9204肝癌细胞爬片。 (五)转染HBVx基因的肝癌细胞中核转录因子NIF—r．B的表达 x基因的肝癌细胞中核转录因 常规免疫组织化学sP法和免疫荧光法同时检测转染HBV rain，5％正常 子NF一出的表达，sP法主要步骤如下：肝癌细胞爬片经3％坞q一甲醇孵育30 DAB—H202液显色，自来水洗，苏术精复染，脱水，透明，封固。免疫荧光法主要步骤为：肝癌 mol／L 体(1：鲫)，4。C过夜；滴加荧光素标记的羊抗兔I书，37C作用30min，0．01 PBS漂洗后直 接在荧光显微镜下观察、照相。对照实验：分别用PBS代替一抗或二抗作为阴性对照。未进 行基因转染的HCC一9204肝癌细胞爬片作为组织对照。 (六)ALLN阻断乙型肝炎病毒X叠白对核转录因子NF—r．B的活化 将对数生长期人HCC一9204肝癌细胞以不同密度梯度接种于培养皿中，培养皿中预先放 30min，60min，2 AIIN作用的 h；用脂质体介导法将peDNA3．1一HBX质粒转染人经50tL‘g，ml 肝癌细胞．于转染后48h，用sP法检测细胞中核转录因子NF—m的表达。对照实验：未经 AILN作用的人HCC一9204肝癌细胞转染HBVX基因。在相同实验条件下检测细胞内核转录 因子NF一心。 I七)MIT比色