慢性乙型肝炎基因治疗目前研究进展.docVIP

慢性乙型肝炎基因治疗目前研究进展 ??? 近年来，核苷类似物抗乙型肝炎病毒（HBV）的研究进展迅速，临床上抑制HBV有确切的疗效，随着临床上可选择的药物增加，对于耐药问题的解决也有一定的帮助。但由于目前该类药物只能抑制HBV病毒的复制，长期服用该类药物的效果还在进一步研究之中。理论上，干扰素具有很强的抗病毒活性，但是在临床应用中效果还不够理想。此外目前各种药物对cccDNA的清除均无良好的效果，难于彻底清除病毒。因此，研究其他治疗策略，仍然具重要意义。本文仅对部分慢性乙型肝炎基因治疗研究作一简要介绍。 ??? 一、反义核酸 ??? 反义寡核苷酸和反义ＲＮＡ ??? 反义DNA/反义RNA分子以碱基互补配对方式结合，抑制、封闭或破坏目的基因结构及其表达的核酸分子，利用反义技术可以研究特定基因的功能，并可抑制、封闭某些有害或致病基因的表达以达到治疗疾病的目的 [1]。 ??? 最近，第一代的反义药物ISIS 14803，针对HCV内部核糖体进入位点（IRES）的20单位的磷酸化修饰的寡OND[5]，目前正在进行2期临床实验。前期实验显示在17名病人中，有5名患者血清中的HCV RNA水平下降了1－3.8个指数级，只伴随轻微的不良反应。由于接受实验的病人大多为正规抗病毒治疗无效的患者，因此，该药有着较好的应用前景。[6] ??? Wu J 等[7]针对HBsAg设计表达反义RNA的载体，转染Hep3B细胞后发现，反义RNA可长期抑制Hep3B细胞表达HBsAg达10个月以上；Zu Putlitz 等也进行了类似的抗HBV的研究，抑制率达60％－75％[8]。 ??? 与反义DNA分子比较，反义RNA分子的获得存在较大的困难。目前除化学合成外，别无其他来源，并且容易降解，因此距临床应用尚有一定距离。 ??? 二、核酶 ??? 核酶是一类独特的RNA分子，其特异性序列通过碱基配对识别并结合靶RNA，催化裂解靶RNA，抑制基因表达，特别是抑制某些有害基因表达。 ??? 乙型肝炎病毒(HBV)为部分双链的DNA病毒。 其复制过程中有一个从前基因组RNA到DNA的逆转录过程。核酶能特异地切割HBV前基因组 RNA，使其丧失模板活性。Weizsacker et al构建了串联的核酶，针对HBV mRNA第2029-2031 nt，2044-2046 nt和2049-2051 nt位点设计的3组锤头状核酶，可有效的切割靶RNA，抑制或阻断HBV的复制，并可减少变异病毒逃逸的机会。Beck et al设计了针对HBV包装点的锤头状核酶，体外切割靶RNA，用U6 snRNA表达核酶与HBV共转染，也可有效切割靶RNA。 Welch et al使用三个发夹状核酶，在Huh7细胞中与HBV共表达，使其HBV表达下降66%，对核酶修饰后则抑制率达83%。 在真核细胞表达的成功，提示对HBV基因治疗有效。 ? ??? 目前核酶在体内应用研究虽已取得了很大的进展，但多处于实验阶段，其在临床上的应用，仍有很长的一段路要走。 ? ?? 三、RNA干扰 ??? RNA干扰是指特异性针对目标基因的同源双链RNA的导入引起目标基因的不表达或者减效表达。是近年来出现的一个具有重大意义的发现。因其具有高效，特异，快速，毒副作用小等优点，很快被应用于抗病毒，生物体基因的表达、调控和功能分析等领域。在抗HIV-1,脊髓灰质炎病毒，流感病毒等人类致病病毒的实验研究中均取得较理想的结果，在转录后水平显著抑制病毒的复制和蛋白表达，作用强度远远超过了反义核酸和核酶技术。 ??? McCaffrey et al设计合成了针对HCV NS5B基因区的dsRNA，当与NS5B表达载体进行共转染时，在鼠肝细胞中观察到dsRNA对于NS5B基因的表达水平抑制率达到75%，如果dsRNA与NS5B的表达载体进行共转染，抑制率可以达到98%。 表明siRNA在抗HCV基因治疗中有较好的应用前景[9]。 ??? 此后，研究人员将RNA干扰技术应用与抗HBV的相关研究，也取得了很好的效果[10-15]。他们分别利用合成的siRNA或者载体表达的shRNA，针对HBV基因序列的不同部位进行干扰，在体内外实验中均取得非常好的抑制效果。Anton P McCaffre[9]针对S基因区设计的shRNA具有显著的抑制效果，抑制率达到94.2%，在正常鼠或免疫缺陷鼠中肝细胞HBV RNA水平较对照组下降了77%和92%，小鼠血清中S蛋白和C蛋白的表达也显著下降，抑制率分别达到88%和99.7%。 ??? 但是由于RNA大量制备，干扰作用的维持，动物实验靶向选择等瓶颈问题的存在[16]，大大制约其发展。质粒载体的应用可以一定程度上缓解RNA制备的问题，但其安全性值得考虑。高水动力法注射是目前唯一应用在哺乳动