08 生物氧化与氧化磷酸化.ppt

2. 过氧化氢酶(catalase) 又称触酶，其辅基含4个血红素 3. 过氧化物酶(peroxidase) 以血红素为辅基，催化H2O2直接氧化酚类或胺类化合物 2H2O2 2H2O + O2 过氧化氢酶 R + H2O2 RO + H2O RH2+ H2O2 R + 2H2O 过氧化物酶 过氧化物酶 谷胱甘肽过氧化物酶 H2O2 (ROOH) H2O (ROH+H2O) 2G –SH G –S – S – G NADP+ NADPH+H+ 谷胱甘肽还原酶 4. 谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase），它可消除H2O2和R-OOH 二、细胞微粒体中存在加氧酶类 （一）微粒体细胞色素P450单加氧酶催化底物分子羟化 RH + NADPH + H+ + O2 ROH + NADP+ + H2O 这类酶催化O2中的一个氧原子加入底物(RH)分子，另一个氧原子被NADPH提供的氢还原成H2O，又称为混合功能氧化酶(mixed function oxidase)或羟化酶(hydroxylase)。 辅酶 Cyt P450属于Cyt b类，与CO结合后在波长450nm处出现最大吸收峰，还有NADPH、黄素蛋白、铁氧还蛋白参与电子传递。 （二）加双氧酶(Dioxygenase)催化向底物双键中加入两个氧原子 例 如： (O2) 色氨酸吡咯酶 第五节线粒体功能分析基本原理 Basic Principles of Mitochondrial Function Analyses 一、呼吸功能和内膜电位等指标评价线粒体氧化还原功能 （一）线粒体呼吸功能 （二）内膜电位水平 （三）ATP合酶亚基的表达 在一定条件下，加入线粒体后，依次定量加入反应底物(苹果酸钠/L谷氨酸钠)、ADP，用Clark氧电极法等记录氧耗曲线，观察线粒体呼吸态的变化。 3态呼吸（ST3）：ADP加入后相应氧耗速率。 4态呼吸（ST4）：ADP耗尽后相应氧耗速率。 呼吸控制率( respiratory control rate, RCR)：线粒体呼吸活性以单位线粒体蛋白耗氧表示 (nmol / min · mg )，其3、4态耗氧之比(ST3/ST4)表示RCR。 （一）检测重要参数显示线粒体呼吸功能 1. ST3：显示有呼吸底物时ADP对氧化磷酸化刺激效应，与电子传递链、ATP合酶活性相关。 2. ST4：四态呼吸时，无ATP的合成，显示质子漏状况。 3. RCR反映氧化和磷酸化偶联程度。 * ST3、ST4和RCR的意义 测定方法及原理：正常的亲脂性的阳离子化合物能结合到线粒体内膜。 1. 罗丹明123 (Rhodamine123)：可被活细胞线粒体特异摄取，且摄取率与膜电位成正比。 2. 染色剂JC-1：内膜电位依赖性荧光染料特性，当内膜电位小于100 mV时，JC-1以单体存在，490nm激发光下形成绿色荧光；内膜电位升高时，JC-1在内膜聚集形成橙色荧光。 （二）内膜电位水平与线粒体正常功能密切相关 跨内膜电位（质子电化学梯度）是反映线粒体呼吸链及合成ATP功能的重要指标，被广泛应用。 （三）蛋白印渍技术测定ATP合酶亚基表达 二、测定蛋白复合物活性反映呼吸链电子传递功能 基本方法：反应体系中含有待测复合体相应底物、电子受体和下游复合体抑制剂，加定量线粒体蛋白温育。加底物启动反应后，在线性范围内以特定波长，检测底物/产物的氧化/还原水平改变。 （一）呼吸链蛋白复合体活性检测显示电子 传递速率 （二）蛋白印渍技术测定呼吸链复合体蛋白 表达 （二）ATP是最重要的高能磷酸化合物 体内许多代谢物的“活化” 反应（吸能）大多直接或间接地与ATP酸酐键的水解放能反应相偶联，使“活化”反应能顺利进行。 O CH2 HO H OH OH H OH H OH H H 葡萄糖 ATP ADP Mg2+ 己糖激酶 (hexokinase) O H OH OH H OH H OH H O CH2 H 6-磷酸葡萄糖 P P ATP ADP 肌酸 磷酸 肌酸 氧化磷酸化 底物水平磷酸化 ~P ~P 机械能(肌肉收缩) 渗透能(物质主动转运) 化学能(合成代谢) 电能(生物电) 热能(维持体温) 生物体内能量的储存和利用都以ATP为中心 人体内ATP的来源和去路: （三）ATP是生物能转换、储存和利用的核心 　 ATP+AM