LPEI介导的siRNA经腹腔给药抑制SPC-A1细胞移植瘤生长的实验的研究.pdfVIP

中华医学会第四届全国胸部肿瘤及内窥镜学术会议资料汇编 大会发言 OR07 的实验研究 复旦大学附属中山医院呼吸科(2000a2) 张萍海张新周磊王悦虹徐欣李卡白春学 RNA干扰(RNAi)技术发展迅速，目前已成为基因功能研究的强大工具，并在疾病如艾滋病、 肝炎和白血病等的基因治疗研究中取得了巨大进展¨q1，因而也为肿瘤基因治疗带来了新的契机。小 interference 干扰RNA(short RNA，siRNA)是RNAi作用赖以发生的重要中间效应分子，但化学 合成siRNA直接应用于体内稳定性差，难以到达靶组织或靶器官，这使其体内直接应用大大受限。 尤其在系统给药过程中siRNA要经过多重组织障碍，要求在血液中大量核酸酶的作用下仍保持稳定 的siRNA浓度H1，以及必须到达靶器官，之后才可能进入靶细胞，因而比局部给药困难的多。除了 RNAi效率，siRNA体内应用还必须考虑生物安全往，包括治疗相关的毒性和免疫原性问题插1。前者 如常见药物应用相关的肝肾功能损伤，后者则包括以往长片段dsRNA体内应用时常见的IFN效应和 刺激免疫系统引起的血清多种细胞因子增多，在siRNA体内应用中，这往往与所采用的转基因载体 系统有关。 现有转基因载体主要包括病毒和非病毒两大类，病毒载体因其潜在安全性问题难以进入临床， 热点，在非病毒转基因载体研究领域中，其己成为衡量其他载体效率的金标准哺1。但目前关于PEI介 导siRNA直接体内应用的研究结果仍较少。 在我们的前期工作中，已经利用化学合成的SiRNA分子筛选出了靶向EGFR基因的最佳RNAi作 用位点，并对其进行了一系列的体外验证口’引。本实验拟以人肺腺癌细胞SPC-AI为研究对象，以低 合物在裸鼠体内对移植瘤EGFR表达和肿瘤生长的抑制效应，以及此治疗模式下是否出现毒性或免疫 原性不良反应，从而对此基于EGFR靶向siRNA体内应用RNAi基因治疗策略的可行性进行较为全面 的评估。 材料与方法t (1)细胞系：肺腺癌细胞株SPC-AI由中国科学院上海细胞生物学研究所提供，用含lO％d,牛血清 RPMI一1640培养基置于37℃、5％C0z、饱和湿度细胞培养箱中进行培养。 (2)实验动物：无菌级BALB／C裸鼠及野生鼠，6"8周龄。体重20±2g，雄性，由中国科学院上 海细胞生物学研究所动物中心提供。 (3)体内转染线性化PEI：in Transfection公司。 vivo-jetPEl瑾，购自法国Polyplus (4)合成已经验证的siRNA—EGFR序列： 正义链：5’-GGAGCUGCCCAUGAGA从U一3’ 反义链：5’一AU叫CUCAUGGGCAGCUCC-3’ 无关序列(siRNA—NEG)作为对照： 正义链：5’一UUCUCCG从CGUGUCACGU一3’ AG从一3’ 反义链：5’一ACGUGACACGUUCGG p (5)荷瘤鼠模型制备；以1XPBS制备成SPC—A1含量为107／ml的细胞悬液2001，注射入裸鼠右 ．．189．． 大会发言 中华医学会第四届全国胸部肿瘤及内窥镜学术会议资料汇编 film×8 腋下皮下；待瘤块长至约8 IIml大小时，处死小鼠，取出皮下瘤组织，无菌条件下在生理盐水 中去除包膜及坏死部分，快速将瘤组织分为l衄×l衄大小均一的瘤块，并迅速接种于另一批裸鼠 的右腋下皮下；每两天观察肿瘤生长情况，约1周后瘤块约4 mmX4锄大小，可进行腹腔给药。 (6)腹腔注射用LPEI／siRNA复合物的配制(N／P=5)：依据invivo-jetPEl’。说明书及小鼠推荐腹 腔注射总液量(每只小鼠0．4～1m1)配制LPEI／siRNA复合物。