禽传染性支气管炎病毒S1、M、N基因真核表达质粒构建.pdf

主垦童塑壁匿堂金煎叠堂坌盒璺土兰选堂查婴煎垒迨塞塞 ·传染性支气管炎· 禽传染性支气管炎病毒S1、M、N基因真核表达质粒的构建。 王红宁 周生 胡慧琼 黄勇 李春 杨帆柳萍 (四川农业大学动物科技学院，四川雅安625014) [摘要]本研究根据国内外及本课题组前期工作已在GenBank中登录的IBVs1、M、N的基因序列设计用于扩增IBVS1、 M、N基因的三对引物．上游引物加上Hind Ill酶切位点，下游引物加上Xhol酶切位点，以本研究已克隆的s1、M、N基因构建的 究为进一步进行IBvs1、M、N基因DNA疫苗的研究提供了基础材料。 [关键词] 鸡传染性支气管炎病毒；s1基因；M基因；N基因；真核表达质粒 Infectious 禽传染性支气管炎(Avian Bronchitis 出现呼吸道症状、产蛋数量和品质下降以及肾脏病变等。禽传染性支气管炎病毒(InfectiousVirus， IBV)可感染所有日龄的鸡，导致生长迟缓、死亡、增重和饲料报酬降低；还常常引起霉形体混合感染以及大肠杆 菌病等继发感染而提高鸡群的死亡率，给养鸡生产带来巨大损失。目前，该病呈世界广泛流行，是严重危害世界养 禽业的重大传染病之一。 株，分属30种以上血清型。IBV不同毒株在毒力、致病性和组织嗜性上存在着很大差异，不同血清型毒株之间交 叉保护力弱。在防制上，常规单一毒株疫苗常有免疫失败的报道，多价疫苗可较好解决防治问题。灭活疫苗安全 性好，不存在散播病原和毒力返强的问题，且能激发良好的体液免疫反应。其不足之处是使用剂量大，需要配合佐 剂，制备比较复杂，因而成本较高。加之灭活疫苗不能诱发机体产生细胞免疫，而～系列的研究证实在IBV的免 究的逐步深入，研究DNA疫苗用于该病预防具有重要意义。 IBV属于单股正链的RNA病毒，基因组全长27．6kb，主要编码三种结构蛋白：纤突蛋白(S)、膜蛋白(M)、 体，为IBV的主要免疫原。N蛋白携带着T细胞表位，在免疫和保护上可能发挥作用。M蛋白的免疫原性较低， 也有报道M蛋白上可能存在着具有重要免疫作用的抗原决定簇，能诱导细胞介导的免疫反应”j。本课题组已在 1材料和方法 1．1菌株和质粒 由本实验室保存。pcDNA3．1(+)真核表达载体购岛invitrogen公司。 1．2工具酶及试剂 1II、Xho DNA聚合酶、DI．2000Marker均购自成都天泰生命 限制性内切酶Hind I，T。DNA连接酶、ExTaq 科技有限公司。胶回收试剂盒、质粒提纯试剂盒购自北京赛百盛基因公司。 1．3引物的设计及合成 根据国内外及本课题前期工作已在GenBank中登录的IBV premier *本研究获国家“863”计划资助(2003AA241120) 传染性支气管炎 Hind III酶切位点；下游引物设计在基因末端，并加上XhoI酶切位点。 ESl：5‘一GGCAAGCTTATGTTGGAGAAGTTACT一3’ ES2：5’GACCTCGAGAACTAACATAAGGGCAA一3’ EMl：5’一GCCAAGCTTATGTCCAACGAAACAA3’ EM2：5’一GCCCTCGAGTACACACACACATTTA3‘ ENl．5‘一GGCAAGCTTATGGCAAGCGGTAAGGCAACT一3’ EN2：5’GACCTCGAGGAGTTCATTCTCACCTAAAGC一3’ 1．4SI、M、N基因的PCR获取 分别以pIBVSI、pIBVM和pIBVN质粒为模板，加入ExTaq oClmin，72C 应。反应参数为：94C预变性5min，然后进入循环，94℃lmin，52 10min。反应结束后，取5／．1PCR反应产物用1％琼脂糖凝胶电泳观察。 1．5s1、M、N三基因真核表达质粒的构建及鉴定 产物用Hind111、Xho (+