磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C在骨髓间充质干细胞(BMSC)向神经元分化中作用.pdf

学术汇编 磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C在骨髓问充质干细胞 (BMSC)向神经元分化中的作用 孙春辉，王楠，苏乐，赵洪令，张尚立，苗俊英 (山东大学生命科学学院，济南，250100) 研究背景和研究目的 骨髓间充质干细胞(BMSC)具有其它干细胞所不可比拟的优点，如取材方便，增殖和分化能力强， 移植无免疫原性等。因此，诱导BMsC定向分化为神经细胞在临床上治疗神经退行性疾病和中枢神经 系统损伤修复具有广阔的应用前景。目前，国内外对骨髓间充质干细胞定向分化调控机制了解很少。 因此，研究骨髓间充质干细胞向神经元分化的分子机制是当务之急。 磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C(PC—PLC)在信号传递过程中具有重要作用，能特异性水解磷脂酰胆 递给丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)，从而参与调控细胞增殖、分化和凋亡。 本实验室在研究PC—PLC在细胞信号转导中的作用时，偶然发现PC—PLC的特异性抑制剂 经元样细胞，进一步研究发现D609能快速的诱导人骨髓基质细胞(hBMSCs)定向分化成神经元样细 胞。但是，D609是否能诱导多种不同来源的骨髓间充质干细胞分化为神经元?D609通过何种途径对 (Rb)，是否参与此过程?D609是否同样可以诱导神经于细胞向神经元分化呢?这些问题目前均尚未 搞清。研究清楚该分化信号的转导途径，将对阐明细胞分化的分子机制具有促进作用。 本研究选用骨髓间充质干细胞和神经干细胞两种多潜能的成体干细胞作为研究细胞分化信号转导 的对象，为研究成体干细胞横向分化的分子机制和信号转导途径奠定了基础。通过诱导这两种成体干 细胞定向分化为神经元，从而为在临床上治疗各种神经系统疾病提供理论依据。 研究内容 (rBMsCs)、人骨髓来源的MSCs(hBMSCs)和人胎盘来源的MSCs(hPMSCs) 2．利用rBMSCs研究诱导条件的优化方案及分化细胞的功能特征 3．研究PC—PLC介导的骨髓间充质干细胞分化中相关的重要分子及信号通路 4．研究PC—PLC介导的神经干细胞分化。 研究结果： 1．D609初步诱导MSCs分化 1．1从大鼠骨髓中分离获得rBMSCs，经3代以上传代后，细胞成分均一，纯度在95％以上，不表达 1．2 D609可诱导hBM— 5—15肛g／mlD609可诱导rBMSCs向神经元样细胞分化，而3—8肛g／ml 中细胞的存活率均下降。 学术{亡黛 2．优化分化诱导条件 分化。 2．2在诱导分化后维持培养8天，FGF一2处理组中分化细胞呈现典型的神经元形态，缺少FGF一 2则导致细胞的大量死亡。细胞存活率检测结果表明FGF一2可以显著提高细胞的存活率(Po．01， PO．05)。 3．分化细胞的功能特征 诱导分化48h后，与未分化的rBMSCs相比：分化细胞中线粒体的膜电势显著增加，随着培养时间 趋势更加明显。随着处理时间延长，分化细胞的线粒体的膜电势升高而静息膜电位逐渐下降，这些特征 与神经元在体外培养过程中的变化趋势相一致。 4．D609诱导rBMSCs分化的分子机制 Ca2+依赖的PC—PLC和Ca2+非依赖的PC—PLC，经10弘g／mlD609处理后，两种PC—PLC的活性均 显著下降(PO．01)。 4．2利用荧光探针DCHF来检测细胞内RoS水平发现，当骨髓间充质干细胞被诱导分化为神经元 并没有明显的变化(PO．05)。 4．3免疫细胞化学检测发现，当骨髓问充质干细胞被诱导分化为神经元时，NF—KB在细胞质上一 Blot检测发现分化过程中，c—fos蛋白水平升高(PO．05)。免疫细胞化学和WesternBlot检测发现 分化过程中，Rb蛋白的水平显著升高(PO．05)。 5．D609对NSCs的分化、凋亡诱导 5．1从大鼠胚胎的大脑皮层组织中分离培养NSCs细胞团。免疫细胞化学方法证实，这些细胞的 Nestin蛋白表达呈阳性。利用血清诱导这些细胞分化后，细胞表达神经元的特异性标记物NSE、NF— L和突触素。 5．2在24—72h，5—15弘g／mL