双波长差吸光度法及后分光技术的应用和发展前景.pdfVIP

双波长差吸光度法及后分光技术的应用和发展前景 李雪志 （本文1996 年发表) 建立在 Lambert—beer 定律基础上的单波长分光光度分析技术，应用极为广泛，但由于单波 长法存在混浊试样对光的散射和比色杯背景吸收等难以克服的缺点，它在高精度测量中的应用受 到一定的限制。为了解决浑浊试样对分光光度测定的干扰问题，美国的 B.Chance 于 1951 年制成 了用振动镜使两束不同波长的单色光交替通过待测溶液的双波长分光光度计（Double Wavelength Spectrophotometer），从而奠定了双波长分光光度法的基础。随着科学技术的发展，双波长分光光 度分析技术已日臻完善，与先进的后分光技术相结合，在生化自动化分析中得到了广泛的应用并 显示出了光明的发展前景。 1 双波长分光光度法的原理 双波长分光光度法是在传统分光光度法的基础上发展起来的，它的理论基础是差吸光度和等 吸收波长。它与传统分光光度法的不同之处，在于它采用了两个不同的波长即测量波长（又叫主 波长 λp, Primary Wavelength ）和参比波长（又叫次波长λs, Second Wavelength ）同时测定一个样品 溶液[1,2]，以克服单波长测定的缺点，提高了测定结果的精密度和准确度。 早期的双波长分光光度计在测定时，两束不同波长的单色光经斩光器（Chopper，一种用于双 波长分光光度计中使光束按一定周期反射，遮断或通过的装置）处理后，以一定的时间间隔交替 照射[1] 比色杯，经待测溶液吸收后，再照到光电管上，产生两个不同的吸光度，再将这两个吸光 度相减，就得到了差吸光度 ΔA 。根据Lamber-Beer 定律, 得： Aλ p = ελpLC + Ap (1) A λs = ελsLC + As (2) 式中 ： Aλ p 、A λs 分别为待测溶液在主波长和次波长处的吸光度 ελp 、 ελs 分别为待测溶液在主波长和次波长处的摩尔吸光系数 L ：光径 C ：待测溶液的浓度 Ap 、As ：分别为待测溶液在主波长和次波长处的散射或背景吸收 当λp 、λs 相差不太大时，由同一待测溶液产生的光散射吸光度和背景吸光度大致相等，即 Ap ＝A s ，将（1）式－（2 ）式得： Aλ p －A λs ＝ ΔA ＝（ελp －ελs ）LC （3 ） 对于同一待测溶液来说，ελp －ελs 是一常数 K ，在光径L 不变的情况下，（3 ）式可简化为： ΔA ＝ KC （4 ） （4 ）式说明，待测溶液在λp 与 λs 两个波长处测定的差吸光度 ΔA 与试样中待测物质的浓度 C 成 ［ ］ 正比。这就是双波长法赖以建立的定量公式 1,3 。 双波长差吸光度法具有可以克服溶液浑浊的影响 、共存组分吸收谱线叠加的干扰，以及减少 比色杯的光学不均一等优点。它的差吸光度在2.5 以内时，线性范围良好。 2 选择双波长的方法[1,3] 双波长差吸光度尽管有许多优点，但是如何正确选择双波长，则是应用的关键。选择双波长 常用的方法有三种： 2.1 根据待测溶液对吸光谱的吸收曲线，选择最大吸收峰对应的波长为 λp ，吸收曲线下端较为平 坦的某一波长为 λs 。 2.2 选待测溶液嗫大吸收峰对应的波长为 λp ，选等吸收点的长为 λs。所谓等吸收点，是指对于 某个波长，尽管待测溶液的浓度不同，但对该波长的光的吸收均相等。 等吸收点所对应的波长叫做等吸收波长。对于吸收光谱具有吸收峰的物质，同浓度下吸光度 相等的两个波长，也是等吸收波长。等吸收波长是双波长法的理论基础之一。应用这一方法的必 要条件是能准确地测定出等吸收点，否则将造成显著的误差。 2.3 选溶液最大吸收峰的波长为 λp，选显色剂的最大吸收峰对应的波长为 λs。该法又称为双波 长增敏法，它的原理是：当向一定浓度的显色剂溶液中加入待测物时，由于生成物质浓度的