抗登革病毒NS1单抗的制备及检测NS1方法的建立.pdfVIP

第22卷 第4期 病 毒 学 报 V01．22 No．4 1 1Q i生!旦 ￡H!蔓垦墨垦』Q堕塞丛生生QEy!基QLQ鱼! 』!!￥ !!!! 抗登革病毒NSl单抗的制备及检测NSl方法的建立 郝永华，王芹，关武祥，修梅红，戴晓霞，郑峰，李伟红 刘峰，刘琴芝，李川，张全福，梁米芳，李德新 (中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室，北京100052) 型NSl蛋白纯化后免疫BALB／c小鼠，通过杂交瘤技术制备单克隆抗体。经ELISA、Western blotting、间接免疫荧 光筛选和鉴定单克隆抗体，进行纯化和HRP标记。通过鉴定每两株单抗之间是否存在竞争作用，选择非竞争单抗 NSl。原核 组合并建立NSl捕获法ELISA。结果获得7株高滴度抗NSl单抗，捕获法ELISA可以检出10ng／mL 表达登革病毒NSl蛋白制备的单抗可以和天然病毒抗原反应，NSl捕获法ELISA可以用于登革病毒感染检测。 关键词：登革病毒；NSl蛋白；单克隆抗体 中图分类号：R373．22文献标识码：A 文章编号：1000—8721(2006)04—0292—05 登革病毒属黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属 (Flavivirus)，分为4个血清型，即登革1、2、3、4型 材料与方法 病毒。登革病毒主要引起登革热、登革出血热和登 革休克综合征，在流行区对人们的健康造成很大影 1毒株、细胞株、载体及宿主菌 1～4型登革病毒、乙型脑 响。近年来，登革病毒感染在全球范围尤其在热带、 炎病毒、BHK21细胞、SP2／0细胞由本室保存，原核表达质 亚热带地区呈逐步上升趋势，流行区域正在扩大，已 2试剂 成为世界上危害较大的一种虫媒病毒病，成为全球 重要的公共卫生问题。 和HRP均为Sigma公司产品；TRizol 000 登革病毒基因组为单股正链RNA，由11 公司产品；ExTaq聚合酶系宝生物工程(大连)有限公司产 个核苷酸组成，病毒有3种结构蛋白和7种非结构 品；限制性内切酶、T4 蛋白。编码结构蛋白的基因区集中于5’端，编码非 结构蛋白的基因区位于3’端，其顺序为：5’C—PreM— RT—PCR Technologies公司的ThermoScriptSystem；弓I物合 M—E—NSl一NS2a—NS2b—NS3一NS4a—NS4b—NS5—3，[23。 成及DNA序列分析由上海生工生物工程公司完成。 目前使用的登革热诊断试剂主要是以全病毒或 3细胞及病毒培养 gle7S培养至单层时，换用维持液(无胎牛血清)分别接种1～ 重组E蛋白为抗原，检测抗登革病毒的IgM和IgG 4型登革病毒及乙型脑炎病毒，待出现90％细胞病变时，收 抗体。由于黄病毒结构蛋白之间具有共同抗原决定 集培养上清用于提取病毒RNA，细胞用来制备抗原片以鉴 簇，存在交叉反应，用登革病毒结构蛋白为抗原的诊 定抗体。 断试剂不能很好地满足临床诊断的需要。NSl