利用实时定量PCR对瘤胃甲酸甲烷杆菌定量方法的建立与应用.pdfVIP

维普资讯 中国农业科学 2006，39(1)：161—169 ScientiaA~riculturaSinica 利用实时定量PCR对瘤 胃甲酸 甲烷杆菌定量方法的建立与应用 赵玉华，王加启 (中国农业科学院畜牧研究所反刍动物营养研究室，北京 100094) 摘要：【目的】解决传统微生物评价方法存在的弊端，寻找快速、准确、灵敏的瘤 胃微生物评价的新方法。【方 法】利用实时定量PCR技术，以16SrDNA为靶序列，建立了瘤 胃甲酸甲烷杆菌 (Methanobacteriumformicicum) 的分子定量方法。 【结果】采用本文所设计的g】物、探针以及相应的PCR反应体系，检测极限可达到30拷贝 (15 个甲酸甲烷杆菌 )，与传统检测方法相比要更为迅速、灵敏。采用实时定量PCR技术所测得的细菌数量与采用传统 的最大或然数记数法所测的细菌数量具有很高的相关性 (z=0．957，P0．01)，表明采用实时定量 PCR方法能够准 确反映瘤胃微生物数量的变化。利用所建立的方法对利鲁杂交肉牛和荷斯坦奶牛瘤胃液中甲酸甲烷杆菌进行了定 量检测。结果表明，利鲁杂交肉牛瘤胃液中的甲酸甲烷杆菌浓度是荷斯坦奶牛的 5．6倍。【结论】利用实时定量 PCR技术建立的瘤 胃甲酸甲烷杆菌的分子定量方法能够准确反映瘤胃微生物数量的变化。 关键词：实时定量PCR；瘤 胃；甲酸甲烷杆菌；定量 DevelopmentandApplicationofaReal—TimePCRApproachfor QuantificatiOnofMethanobacte m formicium inRumen ZHAO Yu·hua，WANG Jia—qi (InstituteofAnimalScience,ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100094) Abstract： [Objective】Tosolvetheshortcomingsoftheconventionalquantitativemehtodindeterminationofrunmen microorganisms．[Mehtod]AqunatitativemehtodfordeterminationofMethanobacteriumformicicuminlumenwasdevelopedby real—timePCRusing16SrDNA inthisexperiment． [Result】Thedetection1imitofthismehodwas30copies(15 formicicumcel1)in25I．tlreactionsystemwihthteprimers，probenadreactionconditiondevelopedinthisstudy，whichisfasternad moresensitivehtna htetraditionalmodeofrqunatificationofmicroorganisms．Thepositivecorrelationbetweenhtepopulationof formicicumbyreal—timePCRnadhtepopulationof formicicumbyrtaditionalmodewasveryhigh(r=0．957，P0．01)，which showde htathtequnatitativemehtodbyreal—timePCR couldaccuratelyreflecthtevariationofulmenmi croorganism ’Spopulation． ThenumbersofM．formicicum inulminaofsteersnadHolsteinCOWS．weredeterminedrespectively．Theresultshowedhtathte concenrtationof formicicum inulmenfluidofsteerswas