鹅副黏病毒病NP、L基因RNA的体外转录合成和其靶脱氧核酶的初步筛选.pdfVIP

598蟋》2010年学术年会 T040073 鹅副黏病毒病NP、L基因RNA的体外转录合成 及其靶脱氧核酶的初步筛选事 母连志” 宋德武丁壮…刘 慧 张晓东 (吉林大学畜牧兽医学院，吉林长春130062) 目的 鹅副黏病毒病(goose—host 业健康发展的病毒性传染病，各种日龄鹅均可感染发病，非免疫易感群感染强毒株时，发病率及死亡率 高达90％以上，而现存的防治措施不能从根本上清除新城疫病毒。为探讨脱氧核酶在抑制GPMV复制 研究，利用体外转录方法制备鹅副黏病毒病NP、L基因RNA并用该RNA对其所设计靶脱氧核酶进行 初步筛选。 材料方法 切位点，从而获得带有T7启动子序列的NP、L基因保守区，并将其连接到PUM．T simple克隆载体上， H 经HindIII和BarnI双酶切反应、菌落PCR、以及基因测序鉴定重组质粒。重组质粒T7．NP及T7一L 经胁n饥II线性化后作为体外转录反应的模板。体外转录反应用RiboMAXruT7 ExpressSystem体外转 化后作为体外脱氧核酶切割反应的底物。根据NP、L基因RNA的一、二级结构各设计合成2种靶向 uL；，Tris．C1(250mM，PH=7．55)2uL，转录产 1023脱氧核酶。切割体系：MgCl2(100raM)l 物1u 11 L。充分混合上述混合物，37℃ L(1pm01)，DZlL(1pm01)，0．1％DEPC处理水补足至10Il EDTAlII 孵育，2h后加入0．5M L终止反应。初步应用3％琼脂糖凝胶电泳进行观察，初步筛选具有 体外切割活性的脱氧核酶。 结果 T7 经测序鉴定，正确地构建含T7启动子的NP及L基因的重组质粒，按RiboMAXTM Express System体外转录试剂盒说明将线性重组质粒转录出高纯度的GP5基因RNA。经体外切割实验筛选， 79％和83％。 讨论 由于L基因太大，不利于体外转录及脱氧核酶筛选，所以选取了其部分保守区，通过构建含有17启 T7 动子序列的NP及L基因保守区的重组质粒。用RiboMAXm ExpressSystem体外转录试剂盒成功制备 了高纯度的NP、L基因保守区RNA，经体外剪切筛选出具有体外切割活性的1种脱氧核酶，其中DZ．12 具有高效切割活性，为进一步研究脱氧核酶在细胞水平、体内水平剪切NP、L基因mRNA，抑制鹅副黏 病毒NP、L基因的蛋白表达奠定了基础，并有望应用于抗病毒药物开发和转基因动物研究。 ·基金项目：国家自然科学基金项目，吉林大学研究生创新基金资助项目． ·叶#者简介：母连志，男，副教授，在读博士研究生，主要从事动物传染病防控研究． ”。通讯作者：丁壮，E,-mail：Ding_zhuang@yahoo．goln．cql