猪骨骼肌shRNA文库初步构建.pdfVIP

猪遗传育种 猪骨骼肌shRNA文库的初步构建 沈鹤，牛鹏霞，李新云，赵书红，樊斌 农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室＆农业部猪遗传育种重点开放实验室，华中农业大学，武汉430070 关键词：骨骼肌：shRNA文库；功能研究；猪 引言 siRNA(smallRNA，小干扰RNA)或shRNA(shortRNA，小发卡RNA)介导的RNA干 interfering hairpin 库技术将会大大提升RNAi功效，为开展大规模、高通量的基因功能分析及基因筛选奠定基础。在本研究中， 将构建猪胚胎骨骼肌shRNA文库，并借助RNAi技术和Gcl2成肌细胞系鉴定骨骼肌生长分化相关基因，进而分 离获得新基因，为猪新基因筛选和基因功能研究提供新资源。 材料与方法 以本实验室赵书红等(2005)获得的猪cDNA芯片杂交数据结果为信息，分析并筛选到杂交芯片中肌肉显 用siRNA Converter TargetFinder(https：／／www．genscript．com／ssl-bin／app／mai)和siRNA Hindm酶切。将酶切后的siRNAs连接进入表达载体pSilencer4．1一neo(Ambion 阳性菌液进行测序，验证已构建完成的shRNA表达载体的序列正确性。 结果 EGF-like 基因同源，该基因编码TIED(tenbeta integrin repeatdomains)蛋白。TIED是一种分泌蛋白，在很多组 PHKB)mRNA相似，p亚基的突变能导致肝脏和肌肉磷酸化酶激酶的缺失进而导致糖原蓄积症，其它功能 未知。 讨论 近几年来，RNAi文库的构建和广泛应用，使大规模、高通量哺乳动物已知及新功能基因的功能研究成为 可能。在本研究中，以筛选的肌肉差异表达基因为靶序列设计并合成了相对应的shRNA序列，将其连入shRNA 表达载体中。目前经测序验证发现了部分阳性菌?，并得到两个在猪中尚未报道的新的基因。此外，也发现 连入载体的shRNA序列由于存在发卡结构，测序存在一定难度。在随后实验中，我们将着手重新构建双向启 动子siRNA表达载体。同时，还将构建完成的shRNA表达载体转入c2c。2细胞系，以验证重组载体的干扰效率。 致谢 本研究受‘973”(2006CBl02105)及国家自然科学基金项目资助。 一303—