第二章微生物的纯培养与显微技术.ppt

基本概念 1、微生物的纯种分离： 将多种混杂的微生物，经某种技术或方法分离或纯化的过程。 2、微生物的纯培养（pure culture)： 在人为规定的条件下培养、繁殖得到一种微生物的培养物。 3、菌落（colony): 单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度形成的肉眼可见、有一定形态结构的子细胞生长群体。 4、无菌技术 （aseptic technique） 在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物污染的技术被称为无菌技术 第一节 微生物的分离和纯培养 一、无菌技术 1、微生物培养的常用器具：试管、玻璃烧瓶、培养皿。 2、最常用的灭菌方法：高压蒸汽灭菌 注意事项： 排净冷空气； 灭菌终了，缓慢降压； 灭菌结束，趁热取出物品。 3、接种操作 二、用固体培养基获得纯培养 1、涂布平板法（Spread Plate method） 2、稀释倒平板法 3、平板划线分离法（Streak Plate） 4、稀释摇管法（厌氧培养法） 2、稀释倒平板法 4、稀释摇管法（厌氧培养法） 1、选择平板培养 根据微生物的特点，在培养基中加入一些抑制剂，使不需要的菌不生长，需要的菌生长后有一定特征，然后挑取单菌落。 分离抗生素抗性菌株，可在加有抗生素的平板上分离。 分离蛋白酶产生菌，可在培养基中加入牛奶或酪素，蛋白酶产生菌在平板上生长会形成透明的蛋白质水解圈。 2、富集培养 主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，更容易从混杂的群体中分离到特定的微生物。 富集条件可从多方面选择，如温度、pH、紫外线、高压、光照、氧气、营养等等。 例如：分离产芽孢细菌，可以对样品进行高温处理，然后再进行培养。 几种常用菌种保藏方法的比较 一显微镜的种类及原理 普通光学显微镜 暗视野显微镜 相差显微镜 荧光显微镜 荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别： 1. 照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上（如下图）； 2.光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜； 3. 有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，用以保护人目。 荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色）， 1933年Ruska发明了以电子束为光源的透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM），电子束的波长要比可见光和紫外光短得多，并且电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比，也就是说电压越高波长越短。目前TEM的分辨力可达0.2nm。 用电子束作光源，用电磁场作透镜,由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。 透射电子显微镜工作示意图（左）和照片（右） 扫描电子显微镜 人类血细胞SEM照片 二、显微观察样品的制备 1、光学显微镜的制片：活体（压滴法）；染色 2、电子显微镜的制片 透射电镜的样品制备 ⑴负染技术 ??? 负染就是用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸的出地方则没有染料沉积，从而出现负染效果分辨力可达1.5nm左右。 ⑵投影技术 见P28 ⑶超薄切片 ??? 通常以锇酸和戊二醛固定样品，以环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式推进样品切片（图2-13），切片厚度20~50nm，切片采用重金属盐染色，以增大反差。 扫描电镜样品的制备：标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。 扫描电镜工作原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与电子束入射角有关，也就是说与样品的表面结构有关，次级电子由探测体收集，并在那里被闪烁器转变为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象，反映了标本的表面结构。 柄细菌的特征形态电镜照片。 a）双鞘不粘杆菌；b）游离臂微菌； c）普氏绿臂菌；d）柄杆菌 鞘衣菌 Sphaerotilus natans（a）相差显微镜照片（b）透射电镜超薄切片 a）星形细菌（Stella，a star-shaped bacterium）；b）方形细菌（square-shaped bacteria ）。左为模式图，右为照片 放线菌的