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人乳头瘤病毒2(HPV2)E2蛋白不同功能区域的 突变点能够影响其转录抑制作用 高晨，雷艳君，姜慧英，石琦，田婵，韩俊，董小平 (中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室北京100052) 中HPV一2与皮肤寻常疣的发生密切相关。我们前期的研究发现，一株发现于巨大寻常疣患的HPV2变异株的E2蛋白存在多点突 变。面且这株变异的E2蛋白能够引起病毒启动子的活性的改变，为了进一步研究E2蛋白这些突变点与病毒启动子之间的关系， 我们根据HPV2突变株的这些突变点设计了不同的引物，分别采用延伸法对标准序列进行突变，实验中构建的这些突变点主要分 消除由于不同孔、不同批次之间转染效率的不同对实验结果造成的影响。通过检测转染细胞上清中CAT的表达量，从而获得不同 E2区域点突变对病毒启动子活性抑制作用的影响研究。结果说明，根据HPV2变异株上的点突变设计的这些突变点分别位于E2 蛋白的C端DNA区、N端的调控区以及两者之间的铰链区，均能够影响E2蛋白对启动子活性的抑制作用。对于这些突变位点与 其启动子活性之间存在的关系的研究，为进一步揭示与这例罕见巨大寻常疣临床表型之间存在着重要的联系提供了线索。 【主题词】HPV2；启动子；E2；突变 人乳头瘤病毒(human E．coliDH5 vector papillomavirus，HPV)是引 起皮肤和肛门、生殖器良性和恶性疣状增生性病变的 2000 主要原斟¨。传统上按照感染的部位及引起损伤的病 ELISA 理特征的不同将HPV分为皮肤型和粘膜型。皮肤型 Kit试剂盒购自Roche公司 1．2 HPV主要感染皮肤上皮细胞，其中HPV-2与皮肤寻常E2蛋白的突变及质粒构建 疣的发生密切相关。LCR区是HPV基因组中基因调 在我们前期的研究中发现一例巨大寻常疣患者组 控重要的部分，人乳头瘤病毒E2可以通过与LCR上织中存在HPv-2基因，且其早期蛋白E2能够引起病 Sites， 毒启动子活性的改变。经过对E2ORF片段测序后， 的反式作用元件一转录因子结合位点(Binding BS)结合来调节早期启动子的活性【2】。E2结构上分C发现存在多点点突变。突变如表l： 端的DNA结合区和N端的转录调控区，中间由一个 非保守的铰链区连接【3j。 我们前期的一些研究发现14J，一株发现于巨大寻 常疣患者的HPV2变异株的E2蛋白存在多点突变， 而且这株变异的E2蛋白能够引起病毒启动子的活性 的改变。在此基础上，我们设计了不同的引物，根据 发现的变异株突变特点和E2的结构特点构建了有不 同的点突变，构建表达E2蛋白的重组真核表达质粒， 并与带有CAT报道基因载体进行共转染，对不同E2 区域点突变的转录抑制作用进行了研究。 1材料与方法 AAGCTI-ATGGAA ， 1．1主要材料和试剂 Primer-E2下游：5’GG脚Cn广ATACAAATGCAG ELISA 检测上清中CAT的表达量，具体操作按CAT ACATATA CCC3’。同时设计E2蛋白N(3252nt)端Kit试剂盒说明进行。 和C端扩增引物(3389nt)，Primer-E2N下游：5’1．5统计学分析 GGATCCTrATGATrCTGCrGAGC)C37．Primor-E2C上 游：5’Cr【：AAGGTGGCTl3GGACTGTD钢1℃AC3’ 根据分离到的突变株上的突变点设计引物，以标准株 胞后CAT的表达量进行两两比较。 为模板，对3037nt、3387nt、3697nt以及3037nt和3387m