伪狂犬病毒转移载体pIE-RG的构建以及双基因共表达的初步研究.pdfVIP

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会 伪狂犬病毒转移载体pIE-RG的构建以及双基因 共表达的初步研究 闺瑾刘琥金梅林． (华中农业大擘固家微生物重点实验室动物病毒室武汉湖北430070) 伪狂犬病是家畜和野生动物的一种重要传染病。对猪的危害最大，现己成为仅次于口蹄 疫和猪瘟的主要疫病之一。白1984年首次报道Hsv-l(1-型单纯疱疹病毒)可作为表达外源 基因的载体以来，疱疹病毒作为载体得到了深入研究和广泛应用。伪狂犬病毒(pseudorabies vims，PRv)同其它一般疱疹病毒一样，不仅遗传稳定、背景清楚，而且含有大量与病毒增 殖无关的非必需区可供外源基因插入，其容量可高达40kb，具有一个优良活病毒载体的基 本特征。伪狂犬病毒(PRⅥ基因组庞大，长达150kb，因此不能采用常规的连接方式将外源 基因导入病毒的基因组，同源重组已被证实是将外源基因导入的一种十分有效的方法，而同 源重组需要有携带外源基因的转移载体。载体上启动子的强度以及表达盒两端同源臂的长度 都对外源基因是否能重组入伪狂犬病毒基因组起着至关重要的作用。 伪狂犬病毒通用载体pIE-cMv是一种优怠的转移载体。其上含有一个人巨细胞病毒启 动子cMv，多克隆位点(MCS)，终止子BGHPoly(A)。两端同源臂的大小分别为0．8kb 和2．5kb，完全满足同源重组的要求。构建多价伪狂犬病毒基因工程疫苗的候选毒株需要构 建双基因或多基因共表达的转移载体。为了验证以pIE七Mv基础构建双基因表达转移载体 的可行性和研究上下游基因表达量之间的关系，本研究利用两种报告基因EGFP(增强绿色 荧光蛋白基因)和DsR酣(红色荧光蛋白基因)分别构建由单cMv启动子并由IRES(内 部核糖体进入位点)连接的和双CMv启动子所驱动的双基因共表达载体pIE-GIR和 是否正确以及初步判断上下游基因表达量之间的关系。 l实验材料与方法 1．1载体、质粒、毒株、菌株、细胞 pTA2_Ds．RED、pTA2cMV、PRVEa株的重组病毒TK他E-，Lacz+由本室构建并保存，大肠 (武汉)。 1．2酶及其它试剂 及限制性内切酶xbaI，NheI等均购自宝生物工程(大连)有限公司mKaRa)。 2000 OptiMEMLipofectAMINETMReagem腊质体转染试剂盒和OptiMEM培养基购自 GIBCO公司。 PcR引物由上海生物工程公司合成。 1．3方法 1．3．1质粒pIEcMv的大量提取 1．3．2载体构建 Red用NoⅡ和EcoIu酶切，回收后于22℃连接过 得到载体pIE．GC。将pIE．GC和p1A2．Ds 夜，鉴定正确得到载体pIE．RG。 ·通讯作者 129l 后补论文 1．3．3PcR扩增鉴定 分别以plBRO和pIBGIR为模板，用EGFP和DsRcd的上下游引物cEGFP．Pl， cEGFP-P2，RFP．Pl，RFP-P2进行PCR的扩增鉴定。 引物序列：cEGFP-Pl：TrrGcTAOCATGGTGAGcAAGGG cEGFP-P2：GGGTCl：AGA．n隗CTTGTACAGCTcGT RFP-P1：T兀TClAGAATGGCCTCCTCCGAG RFP-P2：r兀’GCGGCCTACAGGAACAGGT 1．3．4转染 分别用pBRG和pIE≈IR转染IBRs-2细胞。 1．3．5荧光检测 分别在转染后的24小时和48小时用荧光显微镜进行荧光检测。 2实验结果分析 1．分别以构建好的转移载体pm母取和pIBRG为模板，用EGFP和DsRed的上下游引 物EGFP．P1，cEGFP-P2，RFP．Pl，RFP．P2进行PCR的扩增。 将PcR产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到了与预计片断大小相符的两条带(EGFP为720bp， Ds Red为678bp) 小时进行荧光检测。 结果表明在转染后的12小时和24小时都能在同一视野中用荧光显微