生物技术制药第5章.pptVIP

第五章 动物细胞制药 第一节 概述 1665年英国物理学家虎克用自制的显微镜发现了细胞，实际上是死细胞留下的细胞壁，不久，荷兰科学家列文虎克才真正观察到了细胞。从此认为细胞是一切动植物体结构和功能的基本单元。 1838年德国的植物学家施莱登和动物学家施旺共同创立了细胞学说。 细胞学说 所有生物都是由一个或多个细胞组成的； 细胞是生命的基本单位； 新细胞是由原有细胞分裂而来的。 细胞培养是将细胞从机体取出，在体外模拟机体体内生理条件进行培养，使之生存和生长。 细胞培养已有近百年历史了。随着细胞生物学、分子生物学、生物化学和基因工程等一系列学科和技术的发展，逐渐形成了细胞工程学。 细胞工程是以细胞为单位，按人们的意志，应用生物学、分子生物学等理论和技术，有目的地进行精心操作，使细胞的某些遗传特性发生改变，从而达到改良或产生新品种的目的，以及使细胞增加或重新获得产生某种特定产物的能力，从而在离体条件下进行大量培养、增殖，并提取出对人类有用的产品。 第二节 动物细胞的形态和生理特点 一、动物细胞的形态 动物细胞属于真核细胞，结构复杂，分化精确，不同细胞执行不同的功能，例如神经细胞具有很长的分支，很多的纤维，以便接受和传递刺激，红细胞呈扁圆盘状，增大其接触面等。但细胞在离体培养时形态会发生变化，根据不同的需要将离体培养的细胞分为三类：贴壁依赖型、贴壁非依赖型和兼性贴壁型。 1、贴壁细胞 生长时必须要有给以贴附的支持物表面，细胞依靠自身分泌的或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长和繁殖。 贴壁细胞单层培养的优点 1、可以很方便地进行完全换液； 2、如果需要高细胞密度，可通过灌流技术完成； 3、很多细胞只有在贴壁时才能更有效地表达产物； 4、可用于所有细胞类型。 细胞贴壁的表面处理可以使用三种物质 1、玻璃，重复使用贴壁效果会降低，用1mmol/L醋酸镁室温浸泡几个小时，再用蒸馏水反复冲洗可恢复贴壁能力。 2、塑料，聚苯乙烯最常用。 3、金属，不锈钢或钛，化学特性呈惰性，具有适合的高阴性电量。 单层培养的放大 1、转瓶； 2、改进的转瓶，玻璃管、增大表面积的转瓶； 3、单元操作系统，玻璃珠反应器、微载体系统。 2、悬浮细胞 生长不依赖支持物表面，在培养液中悬浮生长，如淋巴细胞等。 3、兼性贴壁细胞 根据生长条件的不同可贴壁也可悬浮生长，中国地鼠卵巢细胞。 二、动物细胞生理特点 1、分裂期长 12-48小时，同一种属不同部位的细胞也不相同，分裂期受培养条件的影响如温度、酸度、成分等。 3、正常二倍体细胞的寿命是有限的。 正常二倍体细胞传代培养都是有限的，大约在50代左右，然后细胞就会逐渐死亡，但在培养基中加入表皮生长因子或经自然和人为的因素转为异倍体后该细胞可转变成无限细胞系，更适合于工业生产。 4、动物细胞对周围环境十分敏感 物理化学因素，如渗透压、酸度、离子浓度、剪切力、微量元素等的变化都会影响其生长，这是由于动物细胞没有细胞壁的保护，所以更敏感。 5、动物细胞对培养基要求很高 原核生物只要有碳源、氮源和无机盐就可以生长；而动物细胞不仅需要12种必需氨基酸、8种以上维生素，多种无机盐和微量元素、葡萄糖外，还需要多种细胞生长因子和贴壁因子。 6、动物细胞蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同。 动物细胞蛋白质的合成在游离和粗面型内质网上都可以进行，内质网上合成的蛋白质多数为糖蛋白，需要糖基化，而细菌细胞则没有糖基化过程。 动物细胞作为宿主细胞生产药物的优点和缺点： 优点：多半可分泌到细胞外，提取纯化方便，蛋白质经糖基化修饰后与天然产物更一致，适合于临床应用。 缺点：培养条件要求高、成本高、产量低。 第三节 生产用动物细胞的要求和获得 一、要求 最初要求生产用动物细胞必须是原代细胞，以后放宽至二倍体细胞即可，即使是经过多次传代也可用，但是非二倍体细胞是绝对禁止使用的，因为担心异倍体细胞的核酸会影响到人的正常染色体，有致癌的危险。由于二倍体细胞传代不会超过50代，所以使用受到限制。后来发现异倍体也可使用，并未对机体产生影响，并且可无限使用，对工业生产带来了极大的方便。 二、获得 原代细胞、已建立的二倍体细胞系及可无限传代的转化细胞系。 1、原代细胞 直接取自动物组织、器官，经过粉碎、消化后获得的细胞悬液。需大量动物，费钱费劳力。 3、转化细胞系 通过转化形成，变成了异倍体，有无限增殖能力。转化可自发，在传代过程中自己转变成可无限增殖的细胞；也可人为转化，采用某些试剂处理，或从动物的肿瘤组织中建立的细胞系。优点：无限传代、倍增时间短、对培养条件和生长因子的要求低，适合于大规模工业化生产。 三、生产常用动物细胞的特性 WI-38：人二倍体细胞系，成纤维细胞，能产生胶原，倍增时间为24小时，有限寿命50代，用于制备疫苗。 M