修订版2脲酶样品的含量测定.pptVIP

酶（蛋白质）工程实验二 ——脲酶的蛋白质含量测定 云南大学生命科学学院生物技术专业系统实验（四） 主要内容 一、实验目的 二、基本原理 三、仪器试剂 四、实验步骤 五、结果计算 六、思考与讨论 一、实验目的 了解酶液样品中蛋白质浓度测定的基本原理和技术方法。 学会用考马斯亮蓝G-250结合法测定酶液样品中的蛋白质浓度。 蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种方法，即凯式定氮法，双缩脲法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝-G250法（Bradford法）。 其中,Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。凯式定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以凯式定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。 四种方法并不是在任何条件下都能适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都有其优缺点。在选择方法时应考虑以下方面：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费时间。 Bradford法法试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1000μg/ml，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。 Bradford法的突出优点是： 1. 灵敏度高:据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。 2. 测定快速、简便:只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。 3. 干扰物质少:如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。强碱缓冲液在测定中有一些颜色干扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响。Tris，乙酸，2―巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污剂如Triton X―100，SDS，玻璃去污剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。但大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。 缺点： 1. 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用γ-球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。 2. 仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。 3. 标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。 二、基本原理 2.1 测定酶液样品中蛋白质浓度的意义 知道酶含量的多少，指导酶的研究、生产、改造和应用。 与酶活力测定结果联合，计算酶的比活力，用于评价酶样品的纯度和活力大小。 2.2 考马斯亮蓝G-250结合法测定蛋白质含量的基本原理 又称为Bradford法，由Bradford在1976年建立。 考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中能与蛋白质的疏水区（多为碱性氨基酸和芳香族氨基酸残基侧链）相结合。 考马斯亮蓝G-250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm。 当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，其最大吸收峰改变为595nm。 在一定范围内（10~100μg/ml），考马斯亮蓝G250-蛋白质复合物呈色后，在595nm下，吸光度A595与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质浓度的测定。 三、仪器试剂 3.1 设备与耗材 漩涡混合器 试管、吸管、容量瓶、量筒 移液器、移液器吸头 分光光度计 电子分析天平 计时器 3.2 试剂 磷酸盐缓冲液：0.2M pH7.0的磷酸盐缓冲液100 mL。 标准蛋白溶液：10mg/ml牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA）溶液，准确称取BSA 1g，用上述磷酸盐缓冲液溶解并稀释至100ml。 待测酶样品液：实验一测定酶活性后剩余的酶液。 无水乙醇。 磷酸（即市售的质量百分浓度为85%的磷酸，比重为1.69）。 考马斯亮蓝染液：0.01%考马斯亮蓝G250溶液，准确称取0.01g考马斯