发酵综合实验讲义.docVIP

发酵综合实验讲义 巢湖学院 化学化工与生命科学学院生物工程教研室 2013年8月 目 录 实验一 PCR基因扩增 2 实验二 单细胞蛋白的发酵生产 4 实验三 200L啤酒酿造 6 附录 10 实验一 PCR基因扩增 一、实验目的 通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验操作技术。 二、实验原理 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。1985年美国的Mullis等人发明了PCR技术，在体外利用模板DNA 、特定的寡聚核苷酸引物和DNA聚合酶，通过DNA变性、复性和延伸过程合成一条互补的DNA链。反复重复这一过程，模板DNA就可得到大量扩增。 典型的PCR反应体系由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。 PCR反应的主要步骤是： 变性：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93℃-94℃）使其变性解成单链； 退火：人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短； 延伸：耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。 PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。但正因为PCR强大的扩增能力，PCR所用离心管、吸头和溶液等都要严格灭菌，以防反应体系被外源DNA污染。 三、仪器、材料与试剂 1、仪器 PCR仪、台式离心机、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像仪、恒温水浴锅等 2、材料 模板DNA、dNTP混合物、引物对、Taq酶、PCR管、微量移液取样器、移液器吸头、琼脂糖、EB等 上游Primer1：5ˊ-ACCG GAATTC ATG GTA GAT CTG ACT AG（EcoR I） 下游primer2：5ˊ-ACCCG AAGCTT CCC GAT CTA GTA ACA TAG（Hind III） 3、试剂 PCR缓冲液（10×，含MgCl2）、无菌双蒸水、50×TAE、10×loading-buffer等 四、实验步骤 （一）质粒DNA模板的制备 以碱裂解法从载有目的质粒DNA的大肠杆菌宿主中提取出目的质粒DNA，作为后续PCR实验的DNA模板。 （二）PCR扩增制备目的基因 1、在0.2ml PCR 微量离心管中配制50μl反应体系： 10×PCR buffer（含MgCl2） 5 μL dNTP Mixture 4 μL Primer1 1 μL primer2 1 μL 模板DNA 1 μL Taq酶 1 μL 无菌双蒸水 37 μL 总体积 50 μL 2、设置PCR仪的循环程序： ① 94℃ 5min ② 94℃ 90s ③ 56℃ 1min ④ 72℃ 90s ⑤ 30 cycles ⑥ 72℃ 10min （三）琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果 PCR反应结束后，取产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。配置0.8%琼脂糖凝胶，50μL PCR扩增产物+6 μL 10×loading-buffer，恒压电泳。凝胶成像仪观察电泳结果。 实验 单细胞蛋白的发酵生产 一、实验目的 1、了解小型发酵罐的结构和灭菌方法； 2、掌握发酵过程的控制方法。 二、实验原理 单细胞蛋白（Single-Cell-Protein，简称SCP）是从酵母或细菌等微生物菌体中获取的蛋白质。微生物细胞中含有丰富的蛋白质，例如酵母菌蛋白质含量占细胞干物质的45%～55%；细菌蛋白质占干物质的60%～80%；霉菌丝体蛋白质占干物质的30%～50%；单细胞 藻类如小球藻等蛋白质占干物质的55%～60%，而作物中含蛋白质最高的是大豆，其蛋白质含量也不过是35%～40%。单细胞蛋白的氨基酸组成不亚于动物蛋白质，如酵母菌体蛋白，其营养十分丰富，人体必需的8种氨基酸，除蛋氨酸外，它具备7 种，故有“人造肉”之称。一般成人每天吃干酵母10～15g，