绵羊肺腺瘤病毒ENV蛋白的亚细胞定位及转化细胞能力及研究.pdfVIP

２０１３ 年中国畜牧兽医学会兽医病理学分会 暨中国病理生理学会动物病理生理学专业委员会学术研讨会论文集 绵羊肺腺瘤病毒ＥＮＶ蛋白的亚细胞定位及 转化细胞能力的研究 １ １ １ １ １ １２﹡ 张宇飞 ，王专家 ，刘月 ，孙晓玲 ，张亚坤 ，刘淑英 （１ 内蒙古农业大学兽医学院，呼和浩特０１００１８；２ 农业部动物临床诊疗技术重点实验室，呼和浩特，０１００１８） 摘要：构建绵羊肺腺瘤病毒囊膜基因真核表达载体并观察绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白在２９３Ｔ 细胞中的定位情况，同时探讨 其是否可以诱导ＮＩＨ３Ｔ３细胞发生恶性转化。 本研究采用ＲＴ⁃ＰＣＲ技术从自然感染绵羊肺腺瘤病的病羊肺组织中克隆完 整的外源性绵羊肺腺瘤病毒囊膜基因（ｅｘＪＳＲＶ⁃ｅｎｖ），并将其亚克隆到真核表达载体ｐＥＧＦＰ⁃Ｃ１中。 构建好真核表达质粒经 ＰＣＲ、酶切和测序鉴定。 同时对ｅｘＪＳＲＶ⁃ｅｎｖ基因进行生物信息学分析。 采用脂质体法将该重组质粒转染２９３Ｔ 细胞，观察 其在真核细胞中的表达及定位情况。 将该重组质粒转染ＮＩＨ３Ｔ３ 细胞，观察细胞是否发生恶性转化。 用软琼脂集落实验检 查转染重组质粒的ＮＩＨ３Ｔ３细胞的生长状态。 结果显示真核表达质粒构建成功并命名为ｐＥＧＦＰ⁃Ｃ１／ ｅｘＪＳＲＶ⁃ｅｎｖ。 ｅｘＪＳＲＶ 囊膜蛋白的氨基酸序列与参考株比对发现该囊膜基因的跨膜区（ＴＭ区）的胞质尾区具有ＹＸＸＭ 基序。 系统进化树表明我 们克隆的ｅｘＪＳＲＶ⁃ｅｎｖ基因属于具有致病性的外源性毒株的囊膜基因。 成功地运用生物信息学软件推导出该蛋白的基本性 质，并预测出高级结构。 亚细胞定位表明 ｅｘＪＳＲＶ 囊膜蛋白主要分布于细胞膜。 转染 ｐＥＧＦＰ⁃Ｃ１／ ｅｘＪＳＲＶ⁃ｅｎｖ 质粒的 ＮＩＨ３Ｔ３细胞接触抑制性消失，可在软琼脂中形成集落。 这说明绵羊肺腺瘤内蒙株的囊膜蛋白可以引起 ＮＩＨ３Ｔ３细胞发生 恶性转化。 本研究为进一步探讨ｅｘＪＳＲＶ囊膜蛋白的结构和功能及其致病机理提供了实验基础。 关键词：外源性绵羊肺腺瘤病毒；囊膜蛋白；转染；细胞转化；ＮＩＨ３Ｔ３ Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｓ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｂｙ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘＪＳＲＶ⁃ｅｎｖ １ １ １ １ ＺＨＡＮＧ Ｙｕ⁃ｆｅｉ ，ＷＡＮＧＺｈｕａｎ⁃ｊｉａ ，ＬＩＵ Ｙｕｅ ，ＳＵＮ Ｘｉａｏ⁃ｌｉｎｇ ， ＺＨＡＮＧ Ｙａ⁃ｋｕｎ ，１ ＬＩＵ Ｓｈｕ⁃ｙｉｎｇ１２﹡ （１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｕｈｈｏｔ ０１００１８ ，Ｃｈｉｎａ ； ２．Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄＴｒｅａｔｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ Ａｎｉｍａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｈｕｈｈｏｔ ０１００１８ ，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｗｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｌａｓｍｉｄ ｏｆ ｅｘＪＳＲＶ⁃ｅｎｖ ａｉｍｉｎｇ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘＪＳＲＶ Ｅｎｖ ｉｎ２９３Ｔ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓａｎｄ ｓｔｕｄｙ ＮＩＨ３Ｔ３ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｂｙ ｅｘＪＳＲＶ Ｅｎｖ． Ｔｈｅ ｆｕｌｌ⁃ｌｅｎｇｔｈｃＤＮＡｏｆ ｅｘＪＳＲＶｅｎｖｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒｏｍｎａｔｕｒａｌｌｙｏｃｃｕｒｉｎｇｓｈｅｅｐｐｕｌｍｏｎａｒｙ ａｄｅｎｏｍａｔｏｓｉｓｂｙ ＲＴ⁃ ＰＣＲｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅｔａｒｇｅｔ ｇｅ