电泳技术-方王楷.ppt

电泳（electrophoresis） 电泳的基本原理 带电的胶粒或大分子在外加电场中，向带相反电荷的电极作定向移动的现象称为电泳。生物分子都带电荷，其电荷的多少取决于分子性质及其所在介质的pH及其组成。由于混合物中各组分所带电荷性质、电荷数量以及分子量的不同，在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速度也各异。因此，在一定时间内各组分移动的距离不同，从而达到分离鉴定各组分的目的。 在电场中，推动带电质点运动的力（F）等于质点所带净电荷量（Q）与电场强度（X）的乘积。 F＝QX 质点的前移同样要受到阻力（ f ）的影响，对于一个球形质点，服从Stoke定律，即：f ＝6π r ην（r为质点半径，η为介质粘滞系数，ν为质点移动速度） 当质点在电场中作稳定运动时：F＝ f 即：QX＝6πrην 在具体实验中，移动速度V为单位时间t（单位为s）内移动的距离d（单位为cm），即V＝d/t。电场强度X为单位距离L（单位为cm）内电势差E（单位为伏特），即 X＝E/L。将这两个公式代入上述公式，得到 U=v/X=dL/Et d=u*Et/L 由此可以得到两种物质移动距离的差为 △? d=(dA-dB)=(uA-uB)Et/L 从这个公式可以看出物质能否进行分离决定于二者的迁移率。 3. 电场强度：过高，产热，样品和Buffer扩散增加，条带增宽；蛋白变性。过低，电泳时间增加，扩散。当需要增大电场强度以缩短电泳时间时，需附有冷却装置 4. 电渗 ：在 电场中液体对固体支持物的相对移动；当电渗方向与电泳方向一致时，会加快颗粒泳动速度，反之，当两者方向相反时，会减慢颗粒泳动速度。 5. 支持介质的筛孔 ：筛孔越小，则颗粒在移动的过程中所受到的阻力也就越大  分 类 按支持介质的不同可分为：⑴ 纸电泳（Paper electrophorisis）⑵ 醋酸纤维薄膜电泳（Cellulose Acetate electrophoresis）⑶ 琼脂凝胶电泳（Agar Gel electrophoresis） ⑷ 聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel electrophoresis）（PAGE）⑸ SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）。 按支持介质形状不同可分为： ⑴ 薄层电泳 ；?? ⑵ 板电泳 ；?? ⑶ 柱电泳 聚丙烯酰胺电泳（PAGE） 血 清 蛋 白 醋 酸 纤 维 薄 膜 电 泳 目的： 1.掌握醋酸纤维膜电泳的基本原理及其临床意义 2.熟悉电泳仪器的使用和操作 原 理： 血清蛋白在pH8.6的巴比妥缓冲液中以负离子形式存在，分子大小、形状各有差异。在电场作用下，可在醋酸纤维膜上分离成。A、α1、α2、β、γ五条区带。电泳结束后，将醋酸纤维膜置于染色液。使蛋白固定并染色，再脱色（洗去多余染料）。将染色后的区带分别剪开，将其溶与碱液，进行比色测定，计算各区带的百分数。 实验操作步骤及注意点 等 电 聚 焦 电 泳 不同物质由于带电性质不同，因而在一定的电场强度下移动的方向和速度不同,可以进行分离。 蛋白质具有许多可解离的酸性基团（－COOH）和碱性基团（－NH2）及其它基团,在一定溶液的pH条件下可解离成带正电荷或负电荷的基团。 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，成为兼性离子，净电位为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。 操作步骤及注意要点 凝胶配制 ： a 取10 × 0.5cm内径的玻璃管，从一端量出7cm作好标记，用橡皮片封底（用两条橡皮圈扎紧），垂直放置。 b 按实验指导page 17 配制凝胶液（按顺序，每加一种试剂后都要轻轻充分摇匀，TEMED最后才加入，加入摇匀后要立即灌胶），用长滴管吸取配好的凝胶液，沿玻璃管注入至7 ml标记平面，缓缓注入，避免产生气泡。 c 立即用5ml注射器配针头注入约0.5cm高的蒸馏水，垂直放置（将长滴管及时清洗） 注意：丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒剂，对皮肤有刺激作用，注意避免直接接触。 电 泳 将已聚合的凝胶去除水层，垂直插入电泳槽的橡皮管中，注意不要漏液。上槽注入5%H3PO4，下槽注入2%NaOH，检查凝胶管上下口内有无气泡，如有必须排除。上槽接正极，下槽接负极，50V预电泳30min，然后将电压维持在250 V，电泳2小时。 剥 胶 用带有针头的注射器吸入蒸馏水，将针头插入凝胶与水之间，使针头慢慢螺旋前进。靠水流压力将胶与玻璃管分开，最后可用吸耳球在一端轻轻施压，将