猪圆环病毒2型PCR检测方法的建立及其应用.pdfVIP

维普资讯 动物医学进展。2008，29(6)：54—57 ProgressinVeterinaryMedicine 猪圆环病毒 2型 PCR检测方法的建立及其应用 唐万寿，王学艳，王晶钰，张彦明 ，李娅娟，刘建鹏 (西北农林科技大学动物医学院，陕西杨陵 712100) 摘 要：参照国内外已发表的猪圆环病毒 2型(PCV一2)的ORF1的基因序列及其相关的PCR检测方法 设计一对引物，扩增 目的片段为 493bp。通过对 PCR检测方法的特异性、敏感性 、重复性试验 ，建立了一种 PCV-2的PCR检测方法。应用此方法对临床样 品进行了检测，阳性检 出率达 51．18 。该方法具有快速、 敏感、特异等优点，可用于 PCV一2的检测和流行病学调查等。 关键词：猪 圆环病毒 2型；ORF1基因；PCR 检测 中图分类号：$852．659．2 文献标识码：A 文章编号：1007—5038(2008)06—0054—04 猪圆环病毒 2型(Porcinecircovirus2，PCV-2) 标准毒株来源于河南省农科院；猪圆环病毒 1型 为无囊膜的单股负链 DNA病毒，是 目前发现的最 (PCV-I)、猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)、猪 小的动物病毒口]。PCV一2感染可引起断奶仔猪多系 瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒 (PRV)、猪细小病 统衰竭综合征、怀孕母猪繁殖障碍、断奶猪和育肥猪 毒(PPV)等参考毒株均 由西北农林科技大学畜禽重 呼吸道疾病 [2]、猪皮炎和肾炎综合征[引、幼龄仔猪 大疫病防治与畜产品安全实验室提供。 A2型先天性震颤[4等疾病。PCV-2是 2O世纪9O 1_2 主要试荆 年代初首先从出现断奶仔猪多系统衰竭综合征的病 病毒基 因组 DNA提取试剂盒购 自百泰克公 猪体内分离出的一种病原，如今已成为严重危害养 司；TaqDNA聚合酶、dNTP、DNA标准DL2000， 猪业健康发展的主要病原之一，引起了国内外学者 均购 自大连TaKaRa公司；其余均为国产或进 口分 的广泛关注。我国自2000年报道首例猪圆环病毒 析纯试剂 。 感染以来，该病已普遍发生，表现为流行范围广，阳 1．3 病料的处理 性率高，混合感染严重，种猪感染率高，在临床上表 取猪脾脏组织 1．0g～2．0g，剪碎，加少量灭菌 现为不同的临床综合征。 PBS(含青、链霉素 100U／mL，pH7．2)用无菌研磨 该病有时呈亚临床感染，所 以做好该病的诊断 器研磨至糊状，再用 PBS按 1：4的体积比稀释成 显得尤为重要 。鉴于 PCV-2对养猪业 的巨大危害 ， 乳剂，--20℃反复冻融 3次，在 4℃以6000r／rain 国内外都对其检测和流行病学进行了一定的研究， 离心 10min，取上清，置一7O℃保存备用。 除了传统的病毒分离、免疫荧光法、ELISA、免疫组 1．4 引物 的设计 化法等方法以外，还建立 了检测 PCV一2的PCR、竞 参 照 GenBank PCV-2 (参 考 登 录 号、 争 PCR、套式 PCR和实时荧光 PCR等诊 断方 EU266599、EU266596、EU136715)的全基 因序列 法 。与传统方法相比，PCR具有较高的敏感性和 中的ORF1序列，利用Oligo6．0-,Primier5．0等生物 特异性，操作简便，是最常见和最普遍 的诊断方法。 软件设计了一对特异性引物 P1／P2。P1：5rgagtct 为了解陕西省PCV-2的流行情况和危害程度 ，我们 ggtgaccgttgc3；P2：5ttcctccgtggattgttc3，引 建立了检测PCV一2的PCR方法，并应用该方法对 物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 采 自陕西省不同地区的疑似病料进行了检测 。 1．5 总 DNA 的提取 1 材料与方法 病毒DNA的提取方法参照病毒基因组 DNA 1．1 病料和参考毒株 提取试剂盒的说 明书进行 。 病料采 自陕