实验三盐析法提DNA与HLA多态性分析.docVIP

实验四 NaCl盐析法DNA原理 DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同利用这一特点选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解而使杂质沉淀 或者相反以达到分离目的 DNA在NaCl溶液中的溶解度先增大后减小在DNA溶解度最低时 DNA从溶液中析出而其他杂质还留在溶液中达到粗提取的目的PCR技术的原理 在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。乙二胺四乙酸新鲜抗凝全血或冻存抗凝全血ml置于2ml离心管中,补3倍体积的红细胞裂解液(0.01mol/L Tris-HCL pH7.6; 0.01mol/L NaCl; 0.005mol/L MgCl2)混合，2500 rpm离心15 min，移去上清，再用同体积的红细胞裂解液两次裂解红细胞，沉淀用生理盐水洗涤1次，收集白细胞沉淀。沉淀中加入150μl TE混匀，再加15μl 10% SDS及蛋白酶Kμl，56消化过夜, 得到清亮粘绸的液体。加入235μl 5mol/L NaCl，轻轻摇匀至少1min，5000rpm离心10min将上清转至另一支1.5m离心管中，加860μl无水乙醇颠倒摇动数次至DNA絮状析出，加860μl70%乙醇混合去盐12000rpm离心3min，上清37℃干燥10min，加100μl无菌双蒸水溶解DNA进行测定分析。 PCR: 1. 聚合酶链反应（PCR）体系：10×PCR buffer（Mg2+plus）2μl，上下游引物各0.5μl（10pmol/μl），Taq酶0.25μl，模板DNA 1μl，dNTP（10 mmol/L）1μl，ddH2O 19.25μl。 2.PCR条件：置93℃变性30S, 55℃退火30s, 72℃延伸1min, 循环35次。 3.结果观察：取扩增产物2ul加入1.5%琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5ul/ml) 样品槽内, 100V电泳30min，凝胶成像系统观察结果。 附： TE的配制方法： 1)??????? 1M Tris-HCl(pH 8.0) 5ml的配制：称取Tris碱0.606 g，加超纯水4ml溶解，滴加浓HCl0.21ml调pH至8.0，定容至5ml。 2)??????? 0.5M EDTA（pH 8.0）5ml的配制：称取EDTA-Na2·2H2O 0.9306 g，加超纯水3.5ml，剧烈搅拌，用约0.1gNaOH颗粒调pH至8.0，定容至5ml。（EDTA二钠盐需加入NaOH将pH调至接近8.0时，才会溶解。） ?3)??????? 1×TE（10 mM Tris-HCl，pH 8.0；1 mM EDTA，pH 8.0）的配制： ? 1 M Tris-HCl（pH 8.0） 1 ml 0.5 M EDTA（pH 8.0） 0.2 ml 超纯水至 100 ml PCR引物的稀释： 引物管子的标记的DNA纳摩尔数x10=TE(μl)，混合后就是100μmol/L或100pmol/μl，使用时用超纯水稀释10倍，得到10pmol/μl引物。 1