快速亲与毛细管电泳法测定普罗帕酮与牛血清白蛋白之结合常数.pdfVIP

2010年9月环渤海第一届暨天津市第十九届色谱学术报告会一仪器展览会文集 快速亲和毛细管电泳法测定普罗帕酮 和牛血清白蛋白之结合常数 张勃，包建民‘ (天津大学药物科学与技术学院，天津。300072) 合的一种常用模式。它主要包括两种研究方法【4】：一种称为“LR”法，是以蛋白为缓冲液添 加剂，以药物为进样样品，测定药物在含有不同浓度蛋白的缓冲液中的迁移时间变化；另一 种称为“RL”法，是以药物为缓冲液添加剂，以蛋白为进样样品，测定蛋白在含有不同浓度 药物的缓冲液中的迁移时间变化。 迁移时间的变化是判断药物与蛋白是否发生结合作用，以及计算结合常数的依据。但是 迁移时间往往受到毛细管使用的时间、内表面的化学性质、使用前的预处理、毛细管柱温等 因素的影响【5】，每次测定都可能有较大差异。、M11iams和Ⅵght6】提出的快速测定淌度法可以 减少这些影响，它可以准确、快速地测定电渗淌度和样品的电泳淌度。目前该法广泛用于涂 层毛细管电泳【7】、非水毛细管电泳峭j的电渗流测定、pKa值【9】测定等。在此，我们把这种快 速测定淌度法应用到ACE中来，并以抗心律失常药普罗帕酮和牛血清白蛋白(BSA)为研 究对象，分别采用“LR”和“RL”法，研究药物(蛋白)在含有不同浓度蛋白(药物)中 电泳淌度的变化，从而计算出二者的结合常数。再通过与传统紫外分光光度法的测定结果作 对比，得出此法的准确定和可靠性。 1 实验部分 1．1仪器与试剂 BeckmanP／ACE Station数据采集工作站，未涂层熔融石英毛细管柱(内径75岬l，外径360lain，河北永年锐 沣色谱器件有限公司)，紫外分光光度计(天津市普瑞斯仪器有限公司)； BSA(长沙欧迈生物科技有限公司)，普罗帕酮(常州制药厂有限公司)、Ⅳ’Ⅳ-二甲基 甲酰胺，磷酸盐、氢氧化钠等化学药品均为分析纯，去离子水。 1．2毛细管电泳条件和实验方法 毛细管柱总长27ClTI，有效长度20crn，电泳缓冲液为20 7．4)， mM磷酸盐缓冲液(pH rim，采用气压进样方式。 紫外检测波长为214 测定电泳淌度时以“LR”法为例，以含不同浓度蛋白的缓冲液作为运行缓冲液，先进 样含DMF的药物样品3s，气压推15s，加8KV电压运行一段时间，最后再进样0．1％DMF 3s，进完样直接气压推出。每个缓冲液条件下平行测定三次。每次进样之前用0．1MNaOH 和缓冲液冲洗毛细管各2min。 2结果与讨论 2．1 快速测定淌度法的重现性 我们对比了快速测定淌度法和传统计算淌度的方法，新方法测定的电渗淌度相对标准偏 n=4)和BSA(RSD％产1．25，n=4)的电泳淌度值也有较高的重现性。 基金项目：天津市科技发展计划项目(08CZKFSH00500) 通讯作者：包建民．E-mail：j]嗡0007@gmafl．锄 42 2010年9月王1=渤海第一届暨天津市第十九届色谱学术报告会-仪器展览会文集 2．2快速测定淌度法测定普罗帕酮和BsA结合常数 (I)“LR”法 普罗帕酮是一种弱碱性药物．在pH7．4缓冲液体系自莆正电。冈此，在正电场中电泳 速度最快，第一个出峰。第二和第三个峰均是DMF。当缓冲液中加八BSA后，随着BSA 浓度的增加，缓冲液粘度增加，样品出峰时间推后。由F药物本身与蛄台物的电泳淌度不一 样，造成普罗帕酎峰形变矮．展宽。根据每组三个峰的出峰时间，计算出特制样品的电泳淌 度，南Scatchmd方程，计算得到持测物质的电泳淌度。药物和蛋白质的结台曲线v_r1041x ．1475．根据所得直线的截距和斜率．即可求出普罗帕酮tjBSA的结台常数K。为1．4Ix103。 ：j ，； ； 三i ：：]一7iUi一=： 一j一“＼／v∥一1 矧—烈二一’一 嗣孓≥ {mJ…、—————～ … 3 圈1普，帕目ⅫBSA结