蛋白表达重组质粒构建是否遇到过如下问题.docVIP

本实验源于一次失败的实验，从平板挑单菌落提取载体pET-32a（+），从EcoRⅠ和Hind Ⅲ酶切位点插入PCR产物-PrP435。但由于单菌落所得载体pET-32a（+）在EcoRⅠ位点突变，由GAATTC突变为GAATTA（已测序），按第一章方法构建重组表达质粒PrP-pET-32a（+），在4℃连接过夜、TSS法转化E.coli DH5a未获成功。而将一周以后在4℃保存的连接液TSS法转化E.coliDH5 a却获成功。我们利用双引物primergenome进行菌落PCR筛选阳性克隆时发现，本应扩增出430 bp的DNA片断，实验结果却扩增出约1300 bp，860 bp，430 bp三个DNA条带。消除所有污染因素后，结果依然是三个DNA条带。由此我们怀疑可能是PCR产物串联以后连入pET-32a（+）。 根据以上现象我们对结果作如下探索：疑似串联重组质粒命名为PrPX-pET-32a（+），PrPX-pET-32a（+）转化E.coli BL21（DE3），进行表达鉴定；EcoRⅠ单酶切PrPX-pET-32a（+），琼脂糖凝胶回收，重新连接，试图获得单拷贝阳性克隆；用引物primervector进行菌落PCR鉴定；使用5′primergenome单引物进行菌落PCR筛选鉴定； PrPX-pET-32a（+）和pET-32a（+）测序。试验结果表明：表达出49 KD蛋白，比单拷贝克隆表达蛋白（35 KD）多15 KD，相当于2倍拷贝串联克隆表达蛋白大小。由于插入片段已突变出两个终止子，所以我们认为PrP435串联数应在2以上，前一拷贝应为反向插入，而后一拷贝应为正向插入。 使用5′primergenome单引物进行菌落PCR，试验结果扩增出约860 bp，420 bp，两个DNA片段，420 bp附近有稍大模糊条带，据此我们认为：串联数应在4以上。因为，由图3-5，使用5′primergenome单引物进行菌落PCR时，上游因物在E1-E6处和PrPX-pET-32a（+）退火，下游引物在H1-H5处和PrPX-pET-32a（+）退火，上游因物带有EcoRⅠ酶切位点可以与载体上E0产生错配。所以E1和H1之间可扩增出430 bp片段，E1和H5之间可扩增出约1300 bp片段，E1和E4之间可扩增出约860 bp片段。E1和3之间Taq酶同时往中间扩增，Taq酶要占一定的空间，就会使下游引物所加的Hind Ⅲ酶切位点和三个保护性碱基消失一部分，扩增出约420 bp（比430 bp小）条带。其他各条带可同理推出。 图3-5串联质粒PrPX-pET-32a（+）多克隆位点 Fig.3-5 The MCS of cascade recombinant PrPX-pET-32a（+） sense strand ， anti- sense strand ， H Hind Ⅲ， E EcoRⅠ， vector 本实验早期我们用EcoRⅠ单酶切PrPX-pET-32a（+），琼脂糖凝胶回收，并重新连接，试图获得单拷贝阳性克隆，但重复多次，经表达鉴定，未获成功。原因是EcoRⅠ位点突变（已测序）。以后重复该实验所用pET-32a（+）EcoRⅠ位点完好，EcoRⅠ单酶切PrPX-pET-32a（+），琼脂糖凝胶回收，重新连接，实验结果获得单拷贝阳性克隆。 PrPX-pET-32a（+）经上海联合基因公司和上海基康基因公司测序均未获成功。原因可能是串联克隆造成的多个长回文序列，形成DNA的某种二级结构造成测序困难。 虽本实验然重复出了失误实验的结果，表达出了相应的蛋白作，但也只是一次探索。建议对以下三个方面作进一步得把探索性研究，首先由于测序无法完成，可进一步做Western-Blot鉴定（使用牛朊蛋白单抗做过两次，非特异性较强，未能得到好的照片）；其次，此方法上游第一个连入拷贝为反向反意义链并产生一个终止子，导致蛋白表达量很低，而且为无用蛋白，若能将引物primergenome两个酶切位点作颠倒，使用单酶切两种PCR产物（酶切位点相互颠倒），作连接以后，再做克隆，可克隆入完全正向连接的串联克隆；再次，此方法上游第一个连入拷贝为反向反意义链，可表达出PrP核心片段的反义肽，可做反义肽方面的进一步探索。 有时候实验中出现串连并不是我们所期望的，如何避免串连，提高连接效率?笔者做过这方面的探讨。具体如下：由于细菌在遗传上的不稳定性，在进行细菌操作时，应挑选多个菌落。在实验过程中曾经遇到pET-32a（+）EcoRⅠ位点由GAATTC突变为GAATTA（已测序），造成连接以后连接产物的串联，就是由于在操作过程中挑选单个菌落造成的。 重组质粒构建通常使用酶切然后胶回收再连接、转化，最后进行阳性克