附件标本采集、分离培养和鉴定.doc

附件2 标本采集、分离培养和鉴定 1. 标本采集 标本采集应在2小时内用无菌方法采集新鲜标本，置于灭菌容器中或直接接种于增菌培养基中，登记好标本编号和来源送检，如不能及时送检，标本要存放在专用的标本运送箱内，包扎好以免容器破损。 1. 1 血液 应根据病程的不同阶段采集不同标本进行检测，宜在发病早期和抗生素使用前采集。抽取病人3～5ml血液，立即接种已在室温（20℃）平衡的血培养瓶中。推荐采血量为10ml。所有情况下，接种的标本量必须做好记录。血培养瓶在室温条件下运送至实验室。 1. 2 血清 余下的2ml病人血液（作为上述采集血液程序的一部分）及病后2-3周采集恢复期血液2ml，分离血清做血清学检测（肥达氏试验等）。 1. 3 粪便 用无菌采便器采集新排出的粪便约1g直接放入增菌培养管（8-10ml沙门菌增菌液）内，尽快送检。 1. 4水样标本 按《伤寒、副伤寒防治手册》中所述的方法进行水源标本的采集和分离培养。 1. 5食品标本 固体食品需剪碎和研磨，奶和奶制品可直接取样增菌，具体操作见《伤寒、副伤寒防治手册》，所用的培养基及鉴定方法参考《中华人民共和国国家标准（食品卫生检验方法微生物学部分）》。 注意事项 采集标本及标本接收时应认真核对名单及标本号，并作好收样记录（附表2）。 2. 分离培养 2. 1 血培养 血培养瓶放在37℃培养箱里培养10天，每天观察生长情况，如出现混浊现象，应马上转种麦康凯/血平板，即使没有肉眼可见的生长，也必须在1、2、7天转种麦康凯/血平板。 2. 2 粪便培养 增菌管37℃培养18～24小时 ，挑取培养物转种到SS平板，37℃培养18～24小时，如果没有观察到有可疑菌落生长，再继续培养24小时，观察结果，挑取可疑菌落。 2. 3水样标本 按《伤寒、副伤寒防治手册》中所述的方法进行水源标本的采集和分离培养。 2. 4食品标本 固体食品需剪碎和研磨，奶和奶制品可直接取样增菌，具体操作见《伤寒、副伤寒防治手册》，所用的培养基及鉴定方法参考《中华人民共和国国家标准（食品卫生检验方法微生物学部分）》。 2. 5 菌落形态 见表1。 表1 沙门菌属菌落形态 沙门菌属 大肠杆菌 麦康凯平板 不发酵乳糖（无色）的光滑型菌落 发酵乳糖（粉色）的光滑型菌落 SS平板 不发酵乳糖、产H2S（中心黑色的无色菌落）或不产H2S 发酵乳糖（粉色）菌落 3. 生化鉴定 从每个标本的血培养瓶转种的麦康凯平板挑取3个可疑菌落，粪便培养转种的麦康凯/SS平板挑取3-5个可疑菌落分别转种到以下培养基： 3. 1 KIA：穿刺2/3中段，在斜面上划线。 37℃培养18～24h，观察生化试验结果，挑取KIA生化管上菌苔做革兰氏染色，并做好记录。 3. 2 符合沙门菌KIA反应的，取该管斜面菌苔转种 MIU：穿刺接种培养基，并沿穿刺线拔出接种针。 西檬氏枸橼酸盐琼脂：在斜面上划线。 *生化结果及血清凝集试验符合菌株转种一个营养琼脂平板（药敏实验用）。 伤寒副伤寒沙门菌生化特性如表2，表3。 表2 伤寒、副伤寒沙门菌生化特性 菌 KIA MIU 乳糖 葡萄糖 H2S 斜面 颜色 中段 颜色 尿素 动力 靛基质 颜色变化 大肠杆菌 u 黄 黄 (有气泡) － ± + 底层不变色加试剂后表层呈吲哚红 志贺菌 － + － 红 黄 － － ± 底层不变色 伤寒菌 － + ± 红 黄 (无气泡) － + － 底层不变色细菌扩散生长 甲型副伤寒菌 － － 红 黄 (有气泡) － + － 同 上 乙型副伤寒菌 － + 红 黄 (有气泡) － + － 同 上 丙型副伤寒菌 － + 红 黄 (有气泡) － + － 同 上 产酸产气；±多数阳性，少数阴性；u多数阴性；少数阳性；+产酸不产气； 碱性反应为红色；产酸为黄色。 4. 血清学鉴定 取符合伤寒、副伤寒菌生化反应的KIA斜面上菌苔用沙门菌属诊断血清做玻片凝集试验，并设盐水对照，见表4。 方法：挑取KIA斜面上菌苔，先用O多价血清凝集，如发生凝集，再选用单价O因子血清凝集（不需煮沸），并用盐水做对照。如果O多价血清不凝集，则用Vi血清鉴定Vi抗原。将细菌制成悬液，经100℃水浴30分钟，破坏其Vi抗原，然后再与O多价和单价血清凝集（先做盐水、O多价、Vi，再做O2、O4、O6.7、O9因子血清。）。 O抗原确定后，再用H因子血清凝集。 不同沙门菌血清型，对O、H及Vi因子血清反应情况如下： 表3 伤寒、副伤寒沙门菌主要生化特性 动力 葡萄糖 乳糖 麦芽糖 甘露醇 蔗糖 硫化氢 靛基质 尿素 甲基红 V │ P 枸橼酸盐 卫茅醇 木胶糖 阿拉伯糖 赖氨酸脱羧酶 鸟氨酸脱羧酶