急性一氧化碳中毒大鼠基质金属蛋白酶-2表达及高压氧干预后的变化.pdfVIP

中华医学会第二十次全国高压氧医学学术会议论文汇编 ·219· 浸蜡、包埋、切片。片厚5肛m，分别进行HE染色和Fas蛋白免疫组化染色(ABC法)。免疫组化步骤 为：胰酶消化，PBS漂洗。加人适当稀释的一抗，4℃，冰箱孵育过夜。加生物素化二抗和ABC复合 物孵育，DAB显色。 1．5组织蛋白样本制备及Westernblot各组另取5只大鼠，经乙醚麻醉并放血处死，取大脑皮层 少量脑组织，按lmL：100 mg组织的比例加入匀浆液，在玻璃匀浆器中充分匀浆后置冰上30rain，再 加入等体积的2×样品缓冲液，煮沸5rain并离心后置一20℃保存。采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SD孓PAGE)，恒压100V电泳1 h，在DYY-III-7型转移电泳仪(六一仪器厂，北京)中将胶中蛋白 h， 转移至硝酸纤维素膜(Sigma，USA)上，脱脂奶粉封闭，加人按比例稀释的一抗，37℃作用l h后， NBT—BCIP显色。 1．6图像分析及统计学处理蛋白表达阳性细胞比例在Leicaquantitation570图像分析系统上自动 Science 计算，用KodakDigital 1D软件系统处理Westernblot分析结果，目的蛋白的表达水平以该条 11．0软件包进行ANOVA及SNK 带的灰度对p-actin灰度的比值表示。所有数据均以表示，应用SPSS —q检验，P0．05为差异有统计学意义。 结果 2．1 HE染色结果：对照组：大脑皮层、海马的神经细胞呈圆形或椭圆形，核膜完整，核仁清晰 可见，细胞核呈淡蓝色。海马区锥体细胞层厚度正常，细胞排列紧密，形态正常。染毒组：在大脑皮层 和海马区出现大量变性、坏死的神经元，尤以染毒后7d组最重，处于损伤高峰。 2．2免疫组化染色结果胞质呈棕黄色的细胞为MMP-2蛋白表达阳性细胞。对照组MMP-2蛋白在 灰白质内表达分布均匀；染毒后1d，在大脑皮层的广泛区域可见灰质及白质内阳性细胞减少。染毒后 3 d，阳性细胞进一步减少，且与染毒后7d组无明显差别。而染毒后立即进行高压氧治疗7d，MMP一2 蛋白蛋白表达阳性细胞显著增加(PO．01)，但较对照组仍显著减少(P0．05)。 2．3 kD．正常脑组织有MMP一2表达，染毒1d后表达降低，染毒3d后达到降低，染毒3d和7 d组无显著 差异。HBO治疗组大鼠脑组织Fas蛋白表达与染毒7d组相比显著增加(Po．01)，但较对照组仍显 著减少(P0．05)。 2．4 子量为26kD和21kD，如图4所示．染毒l d后出现Bcl-2蛋白表达降低和Bax蛋白表达增高．染毒3 d和7 d后达到峰值，染毒3 d组无显著差异。HBO治疗组大鼠脑组织Bcl-2蛋白表达与染毒7d组相 比显著增加(PO．01)，而Bax蛋白表达与染毒7d组相比显著减少(PO．01)，但二者较对照组仍 显著增多(Pd0．05)。 讨论 近年来，国内外学者在急性C0中毒后DNS的发病机理研究中发现，Co中毒后脑组织的损 伤涉及多种机制，如缺氧、自由基生成增加、免疫反应、血脑屏障功能障碍等。细胞凋亡是延迟性细胞 cell 死亡(Delayed death)的主要形式，目前认为，正常情况下，脑神经元无细胞凋亡，而在急性和慢 性脑损伤的发生中，细胞凋亡则发挥重要作用。如在创伤后的继发性脑损伤中，促凋亡相关基因如Bax 和caspase一3表达均增高，而抑凋亡基因bel一2的表达则降低，且与脑损伤的严重程度密切相关。基质金 属蛋白酶(matrix 参与细胞外基质的降解．对于生理情况下细胞外基质动态平衡的维持、细胞凋亡和病理情况下炎症反 应、肿瘤浸润和转