siRNA反向转染法提高原代悬浮细胞转染效率的应用.docVIP

siRNA反向转染法提高原代悬浮细胞转染效率的应用 作者 单位 杨萍　　 江苏大学附属医院心血管内科， 江苏 镇江 严金川　　 江苏大学附属医院心血管内科， 江苏 镇江 刘培晶　　 江苏大学附属医院心血管内科， 江苏 镇江 RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)进入细胞后，按照碱基互补配对原则与靶mRNA完全互补配对，进而引发靶mRNA的降解、抑制靶基因的表达。RNAi因其对靶基因的沉默具有高度的特异性和强大的抑制作用正越来越多地被应用于多种疾病的预防和治疗研究[1]。siRNA必须进入细胞内才能发挥对基因的沉默作用[2]，因此，如何将外源性siRNA高效地转入靶细胞就成为基因抑制成功与否的关键。 基因转染的方法很多,如磷酸钙沉淀法、电穿孔、脂质体法、显微注射法、逆转录病毒法等。 逆转录病毒是目前效率最高的转染载体，但由于其价格昂贵，构建耗时而不作为实验的首选。阳离子脂质体法是较方便的转染方法之一[ 3]，在各种体外培养细胞的RNA干扰实验中,多以阳离子脂质体进行转染，但其对于原代悬浮细胞仍存在转染效率低的问题，故本实验在脂质体的介导下，运用反向转染法[4]和传统正向转染法转染小鼠脾淋巴细胞，比较两种方法的转染效率，寻找对原代悬浮细胞更高效的基因转染方法。 1 材料与方法 1.1 实验材料 8～10周清洁级 BALB/c 雌性小鼠(扬州大学比较学院实验动物中心)，小鼠淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品科技有限公司)，RPMI1640培养基，OptiMEM无血清液体培养基(Gibco公司)，小牛血清(杭州四季青公司)，Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen公司)，Cy3荧光标记的siRNA片段(广州锐博生物科技有限公司)，24孔板(Corning公司)， 荧光倒置显微镜(Olympus公司)，流式细胞仪(BD公司)。 1.2 研究方法 1.2.1 小鼠脾淋巴细胞收集 断颈处死小鼠，75%乙醇浸泡2～3 min,无菌超净台内取出脾脏，将200目无菌不锈钢筛网置于60 mm平皿中，加入适量Hank′s液，脾脏剪成碎块置筛网内，无菌玻璃注射器活塞轻柔研磨，使得分散的单细胞透过筛网进入Hank′s中;Ficoll密度梯度离心法分离淋巴细胞，用PBS将所得细胞沉淀洗涤两遍，重悬于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中，计数及台盼蓝染色计算活细胞数。 1.2.2 细胞转染 实验共分为3组。实验组采用反向转染法，①每孔加Cy3siRNA 1.5 μl至不含血清的OptiMEM简化培养基200 μl中稀释;②用前摇匀RNAiMAX, 取3 μl至每孔中，与①液轻柔混匀成为转染复合物，室温孵育20 ～30 min;③用不含抗生素的RPMI1640完全培养基稀释细胞，每孔细胞悬液为400 μl，整细胞数为(1～1.5)×106，加入②液中，轻微前后推动平板使其混匀，每组设复孔。对照组按照传统的正向转染法操作，先将细胞在孔板中孵育24 h后再加入转染复合物，所加物质用量及浓度与实验组完全相同。空白组未转染siRNA细胞。将3组细胞均置于5 % CO2、37℃饱和湿度的孵箱中培养，于4～6 h后更换含10%小牛血清的完全培养基。 1.2.3 细胞活性测定 转染后24 h每组细胞各取1×106，分别用0.4 %的台盼蓝染色5 min后,随机各选取3个视野,显微镜下计数所有细胞。以下列公式计算细胞存活率：细胞活性=(总细胞数-着色细胞数)/总细胞数×100%。实验平行重复3次。 1.2.4 细胞生存状态观察 转染后24 h倒置显微镜下(10×20)每组随机取3个视野观察各组细胞，从细胞形态、细胞膜完整性、细胞数目等方面评估生存状态。 1.2.5 荧光倒置显微镜观察转染效果 转染后24 h，荧光倒置显微镜观察各组Cy3siRNA转染细胞的荧光携带率。Cy3为红色荧光标记物，应用Cy3siRNA转染小鼠淋巴细胞后，根据细胞内红色荧光的数量来判断转染阳性细胞的数量[5]。于可见光下固定一个视野, 计数细胞总数, 转换荧光光源计数携带红色荧光的细胞数,转染效率=有荧光表达的细胞数/细胞总数×100%, 每组选取3孔细胞，每孔细胞随机选择5个观察视野，重复3次。 1.2.6 流式细胞仪检测转染效率 转染后24 h实验组和对照组各取 1×106细胞，4℃ PBS洗细胞2次。流式细胞仪计数发红色光的细胞数，计算转染效率。