利用DNA shuffling技术构建含5个cry基因的突变体库以筛选高毒力杀虫蛋白.pdf

No．1 第30卷第l期 华中农业大学学报 V01．30 of 2011年2月 Journal Agricultural Feb．2011，13～17 Huazhong University NAshuffli 利用D ng技术构建含5个cry 基因的突变体库以筛选高毒力杀虫蛋白 张小琼林拥军 华中农业大学生命科学技术学院，武汉430070 shuff- ling的体外分子进化技术构建1个含有1000个重组基因克隆的大肠杆菌表达库；通过诱导表达重组蛋白。 ELISA方法测定蛋白表达量，以棉铃虫(Helicoverpaarmigera)为试验昆虫进行毒性试验。结果显示：重组克 隆的蛋白毒性与阳性对照CrylAc相比，增强的有122个，持平的有38个，有毒性但毒性降低的有232个，失去 毒性的有608个；对这1000个重组克隆进行了测序。比较_r重组基因与原始基因的序列同源性，除去55个克隆 未能找到其原始基因来源，将其余的945个重组克隆从5个Cry蛋白的核苷酸编码序列的同源性出发，划分为 降3组。对1000个重组基因的氨基酸序列进行分析后发现，相对于毒力上升和持平组，5个毒力下降组的重组 克隆间的氨基酸序列同源性最低。 关键词DNAshuffling；Cry蛋白；序列比较；突变体库 中图分类号Q78 文献标识码A 文章编号 1000-2421(2011)01—0013—05 1901年，日本学者石渡从染病的家蚕体液中首在实验室用于改造基因，如更高表达量的荧光蛋 次分离m苏云金芽胞杆菌(Bacillus 白[7j或者更易结晶的蛋白[8|、改变酶的理化性质[9] thuringiensis， Bt)，并证明它对部分鳞翅目昆虫有杀虫活性[1]。现等。在实际应用方面如改造商业用酶[10|、医用疫 已从不同Bt亚种中分离出对不同目的昆虫有特异苗[¨j、病毒育种[12]等也获得好的效果。这种改造 毒杀作用的杀虫晶体蛋白。昆虫取食Cry蛋白，在方法简单易行，可以多位点同时进行改造，并且可以 昆虫的中肠水解活化产生毒蛋白并与肠道上皮细胞 同时优化不同的理化性质[133；相较于传统的改造手 上的受体(BBMV)结合，产生4,；YL，破坏渗透平衡，段，还具有同时多基因改造r14]且可以根据需要调整 引起中肠细胞的裂解，导致昆虫的死亡[2]。 技术手段[1}16J的优点。DNAshuffling技术在Cry 7。。 过去Bt基因的改造方法主要是定点突变I-引、寡蛋白方面改造的研究也有开展，但研究不多L1 核苷酸替代及结构域交换L4J等。这些研究为Bt基 本研究旨在通过对5个Bt杀虫晶体蛋白基因 的DNA 因的认识提供了很多帮助，但这些传统的方法有一 shuffling的改造，获得一些新的编码高毒 定的局限性。DNA 力杀虫蛋白的基因。 shuffling是一种基于PCR的新 的体外定向分子进化技术。它利用DNase工将欲改 1材料与方法 造的基因或基因家族打断成一定大小的片段，在 PCR的复性过程中，利用片段问部分同源性发生错1．1基因来源 配，错配的片段互为模板进行延伸。这些基因在延