大肠杆菌药敏试验简易方法.doc

大肠杆菌药敏试验简易方法 近年来，随着养鸡业的迅猛发展，鸡大肠杆菌病的发病率和死亡率也不断增加，现已成为危害养鸡业（特别是肉鸡）最为重要的疾病之一，为细菌病之首。因此，广大养鸡户谈之色变，没有比感染病毒病又继发大肠杆菌病更糟糕的了。正因为如此，抗生素得到了大量广泛的应用，又由于大肠杆菌对抗生素容易产生耐药性，所以大肠杆菌的耐药性问题日益突出。如何解决这个问题将是畜牧兽医工作者今后工作的重点。而就目前来说，通过抗菌药物敏感性试验（药敏试验）选择敏感药物对鸡群进行预防和治疗是降低大肠杆菌病发病率和死亡率的有效手段。标准的药敏试验（纸片扩散法）比较繁琐，要先进行细菌培养，再进行药敏试验，试验设备要求高，基层兽医诊疗机构很难做到，现介绍一种简易药敏试验方法（纸片扩散法［1］）。 1试验方法和步骤 1.1试验设备恒温培养箱1台、干燥灭菌箱1台、酒精灯1个、接种棒（带接种环）1个（接种环可用回形针自制）、手术剪1把、镊子1个、普通营养琼脂1瓶、玻璃平皿（直径90mm）数个、烧杯（500ml）1个、玻璃棒1个、普通电炉1台、定性滤纸1盒、 蒸馏水适量、生理盐水适量、小玻璃瓶（如链霉素瓶）数个（洗净晾干）、钢笔1支、细针头数个、高压蒸汽灭菌锅（可选）1个、普通天平1台、药勺1个、尺子1个。 1.2普通营养琼脂平皿制备 1.2.1平皿消毒将玻璃平皿洗净，晾干。用干燥灭菌箱120℃灭菌1小时；也可用酒精灯火焰消毒，将玻璃平皿内壁靠近火焰，同时慢慢转动平皿使之均匀受热，待平皿内壁上水珠烤干并发烫为止。 1.2.2琼脂消毒营养琼脂与蒸馏水（或生理盐水）以3g：100ml的比例加入烧杯（先加蒸馏水，后加营养琼脂），用电炉加热同时用玻璃棒搅拌，使营养琼脂溶化均匀。如有高压蒸汽灭菌锅可将溶化的琼脂液装入生理盐水瓶中（不超过其容量的2/3），瓶口留一通气孔（一般用16号 针头刺入瓶盖），将瓶站立放入锅内，加热至121℃保持15分钟即可；如无高压锅可直接用电炉加热至沸腾后立即将烧杯从炉上拿下来，待泡沫消了，再放到炉上，如此煮约20分钟（煮时不断搅拌）。 1.2.3琼脂导入与保存将消毒好的琼脂趁热通过玻璃棒引入平皿（也可直接倒入平皿），每皿约需20～25ml琼脂液，琼脂厚度约3～4mm，倒完盖上平皿，凉透放入冰箱（2～8℃）备用，一般保存不超过1周。 1.3药敏片制备简易方法是将滤纸片用打孔器或剪刀剪成小圆形（直径约6mm）或小正方形，用干燥灭菌箱灭菌备用。将适量药物放入小玻璃瓶中，用少量无菌蒸馏水（注射用水）溶解稀释（液态药物不稀释），然后放入滤纸片并浸湿，再将小瓶中多余的药液沥净，瓶壁贴上写有药名及批号的标签，然后将小瓶放入恒温箱（37℃）烘干备用。 1.4接种病原由于大肠杆菌在普通培养基上生长良好，且病死鸡内脏大肠杆菌含菌量很高，因此可以直接用接种环蘸取病死鸡内脏组织（肝、心包、气囊等），然后均匀涂布于琼脂表面，但注意不要划破琼脂。然后在平皿底壁中心及四周用钢笔写上药物名称（一般一个平皿做五种药物），再用细针头蘸取药片贴到琼脂上（与所写药名的位置对应），最后放入恒温箱37℃培养18～20小时观察结果。 1.5结果判定抑菌圈直径与药物敏感性关系见表1、表2。 表1简易药敏试验结果 抑菌圈直径（mm） 敏感性 ＞30 极敏感 20～30 高敏感 15～19 中敏感 ＜15 低敏感 0 不敏感 表2标准药敏试验结果［2］ 抑菌圈直径（mm） 敏感性 ＞20 极敏感 15～20 高敏感 10～14 中敏感 ＜10 低敏感 0 不敏感 2与标准方法不同点 2.1消毒方法平皿、烧杯等玻璃器皿可用酒精灯火焰消毒。 2.2琼脂浓度琼脂粉与蒸馏水（或生理盐水）的比例可适当小些（3g：100ml）。 2.3平皿制作制作琼脂平皿时，如没有高压蒸汽灭菌锅，可直接将琼脂液煮沸消毒（约20分钟），煮沸不能使琼脂液完全无菌（细菌芽孢仍可存活），但因所涂病变组织含菌量高，增殖快，即使平皿上有少量细菌芽孢（繁殖慢）也不会影响结果。做好的平皿要检查灭菌效果，可任选一平皿放恒温箱培养24h，如无可见菌落生长则合格，否则应全部丢弃。 2.4病原接种因病死鸡（有“三炎”病变）内脏大肠杆菌含菌量高，因此可以省略细菌培养一步，直接蘸取病死鸡内脏组织均匀涂布于琼脂表面。 2.5药敏片制作抗大肠杆菌药多为复方制剂，因此使用哪个厂家的药就应用此药做药敏片，药粉可不按要求稀释只要能溶化即可，但要保证所选药物质量过关，药中成分含量足，所标量即为治疗量。 3判定结果时抑菌圈直径偏大原因 3.1药物浓度 由于本试验药敏片制作是直接将滤纸片浸入液态药物或药粉溶化后的溶液，药物未按标准稀释，浓度高，所以抑菌圈一般偏大。 3.2琼脂浓度 琼脂制作时琼脂液浓度比生产商推荐的浓度（4.