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PCR常见问题分析 * _. u4 U4 j/ R5 O g* O/ w3 n+ |PCR在产物序列中引入了错误？+ N7 w% ?4 b N参考见解：??I: [% B `% c# E, C _% B1??聚合酶忠实性低：使用带有校正活性的热稳定聚合酶，如Platinum Pfx DNA聚合酶。4 `/ p Q/ }4 d2 循环数太多：降低循环数。! f% O2 m% B??Q/ W3 四种dNTP的浓度不同：制备新的dNTP混合物，保证四种核苷浓度相同。使用预混合物。??A1 H- l% @# L, ?8 a- c5 U* n% |一步法和两步法有什么区别吗？% g, F3 A `3 u. _ \参考见解：其实一步法并非是两步法的改进，根据实验目的不同，有时两步法会更好。举个例子，如果想对同一样本同时扩增2个以上的基因，那么一步法是从RNA开始的，即分别取相同量的RNA，然后逆转录，然后加入不同的primer PCR，方法固然简单，但逆转录酶很贵。如果两步法，可将RNA逆转录为cDNA，然后每次加入相同量的cDNA，再加不同的引物PCR，这样可比性强，而且不需逆转录，直接PCR即可。当然，如果想快速获得某一种基因，当然一步法好。所以一步法和两步法各有优点，不能一概而论。. c( `- o4 S0 @% i9 ~1 APCR跑胶，目的条带很亮，但是边沿不清楚，前后有拖尾现象，请教各位是什么原因？$ e n7 V+ P* S0 J1 Q3 ^- R参考见解：$ W6 f6 \7 i??h; d1模板可能有降解，建议避免反复冻融，放置时间不能太长。模板的质量是最重要的。+ c??f, i1 ^5 X$ o2抽提RNA时有污染，包括基因组DNA污染和蛋白质污染，需重做抽提。; p7 M# K- O! @ j9 z) y6 _3提高退火温度，减少非特异性扩增。$ O1 r ]# m: S, }) ?+ J??~) Q2 j4减少循环次数，减少非特异性扩增。9 \. D! Q8 f0 _$ j5电泳缓冲液时间太长，ph值和盐离子浓度明显改变。. x m2 U! N- P6电泳时电压不能太高，8V/cm。! }+ b* H1 T2 p6 m) X# I7一般来讲，基于promega和TaKaRa的PCR反应体系中，Mg和dNTP的浓度是相匹配的，不需改动。( n) d8 |) G) f/ j3 ^/ K5 f2 `8 加样量过大。过多的量会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散，对于较大的DNA此现象更明显。4 \) v+ ?2 Q: |4 e; g8 [9制胶过程中胶孔没制好。( v6 I5 o, o, F! o B10 EB没有冲洗干净。7 o4 c$ ^; _ o5 \/ c9 Z) i* ]! t11模板混有基因组DNA，或模板中混有蛋白。; J2 _2 \1 P W12非特异反映。引物设计的不好，非特异，这种情况容易出现非特异扩增造成有非特异性扩增带或拖尾现象。6 U9 s7 y9 u0 v/ m3 C4 x( U9 K13电泳液用久了不换，电泳胶脏了 。5 E. p5 M$ S* Z( R2 d$ _14扩增的条件不合适，一般退火温度低时容易使引物在非特异位置结合引发扩增反应造成拖尾。0 e0 P$ G7 W# K- F) t5 X+ S针对以上情况，可以先提高退火温度试试，如果实在不行，再看看引物是不是合适。 s0 t r J4 ?+ C- H　　如果内参可以扩出来，只能说明程序可能是适合的，但不能完全说明体系合适。体系内的各组分，如模板、dNTP、Mg离子、引物等都可能造成拖尾。先得考虑换了那种成分后出现了拖尾，逐项试验。引物当然是最重要的因素，但绝非造成拖尾的唯一原因。而且，一般而言，拖尾不会是引物的问题，尤其是已经被用过证明能扩出特异片段的 引物，更不可能是它的问题了。先不要加Taq酶，等到其他东西都加完了以后，放到PCR仪上去，到那时再加，马上开启PCR程序试试。( W7 z6 d3 C9 s, I6 i检查一下你的dNTP的量够不够。适当减少2～3个循环试试，可能会有效果。- J??t. A% y5 S$ S% Z7 R1 u( k0 I9 {PCR结果总是不满意，请问要注意些什么？: K8 V) u0 k- M# X0 B% g6 f8 q M参考见解：% H7 L??Q4 b$ X v2 |5 f1将PCR反应的试管与反应板紧贴。 9 d8 O8 ?$ P c S$ ?4 O5 ?+ u( S8 X2当酶反应混合物以70℃“热启动”开始循环时，切记在加入酶后稍微振荡一下，因为在0.2-ml的PCR管中不能均匀传热。 ) s: E) A, }0 ]! P