几种蛋白酶活力测定新方法.pdfVIP

维普资讯 一 侈 《生命 的化学H997年 17卷 6期 4l 几种蛋 白酶活力测定新方法 陈安和 西南师范大学生化教研室．重庆630715 ．Q c 关- 么 近年来，蛋白酶特别是丝氨酸蛋 白酶及 光增加量与DNA 的浓度呈正 比。 其抑制剂已成为研究热点 众多研究表明，蛋 当蛋白质 如组蛋 自 与 DNA 结合时， 白酶在许多重要的生命活动过程中发挥着十 阻止了澳 乙锭的插入 ，结果，荧光消失 。组蛋 分重要的作用。蛋 白酶参与蛋白质的水解、消 白与 DNA 有非常高 的亲和力 ，组蛋 白加入 化 、血液凝固与血栓溶解 、血管形成 、炎症、受 双链 DNA溶液时，全部结 台到 DNA双链 精 以及细胞生长和维持细胞的形态等_1] 蛋 上，溶液中没有游离的组蛋白存在 ，直到所有 白酶及其抑制剂还与许多疾病的发病机理有 结合部位都饱和。溶液荧光的下降量与组蛋 关 它仍可以调控病毒的侵染力、 噬菌体的 白的加入量呈正 比。 发育、细菌的致病性、肿瘤的侵染等。蛋白酶 在 DNA一组蛋 白一澳 乙锭潜藏 中加入蛋 及其抑制剂在^类疾病的治疗 中也发挥着重 白酶时，蛋 白酶水解结合在 DNA链上 的组 要的怍用 。如蛋白酶抑制剂已在高血压、阿尔 蛋白，使 DNA 结合部位暴露出来 ，澳乙锭重 滋海默氏病、a一抗胰蛋 白酶缺乏症以及吸烟 新插入 DNA 双链 中，荧光增加量与蛋 白酶 引起的肺气肿等疾病的治疗 中得到应用I2]。 活性星正比。据此 ，通过测定 DNA溶液的荧 此外，蛋 白酶还在食 品加工、啤酒生产及洗涤 光增量来计算蛋 白酶的活性 。 剂中得到普遍的应用。 1．2 酵活性测定方法 由于蛋 白酶研究的兴盛 ，使蛋 白酶活性 1．2．1直接荧光测定 测定的方法也得到了发展 。这里简要介绍几 在 l7×75ram 的硼酶玻璃管中，加入含 种各具特色的蛋白酶活力测定的新方法。 有 0．5／~g／ml滇 乙锭 的pH8．0的 Tris缓冲 1．DNA／澳乙锭荧光分析法_|] 液 1．2ml和 10#1DNA一组蛋 白复合物 其中 1．1 基本原理 古 0．5Fg牛胸腺 DNA 和 1．5Fg完整组蛋 澳 乙锭插入 双链 DNA 的碱基对 之间 白 ，于 37oc平衡 5分钟后 ，加入约 lOIll蛋 时，可使 DNA的荧光增加 25倍 接近饱和 白酶 ，在一定的间隔时间内，测定荧光增量。 的澳 乙锭 0．5t~g／m1 与 DNA 混合时 ，其荧 激发波长为525nm，发射波长为 600nm。 39 参 考 文 献 [6]AbeM ．G ，]996，]74，l914194 [7]Afn~aJA 4．G ．1996．176I23~26 [1]RenaultPd ＆，]996，183|175~]82 [2]张智莆 麓立红、候云蕾 《病毒学报3．i990．6：1]1 [8]~h／EawaJ ．FEMSMicrobiologyLe／ter,~ ～ 116 1996，145：113～n 6 [3]DQbels“4． ．1993．]28I97～101 [9]D，s0nPJ 4．6 ．]996，171：71~73 [4]MartenD 口．G ．1997，196：197~2G0 [10]OhlR 口．G ．1996．174：315~318 [5]LiuCQ Ⅱ．Curr*~tMicro~otogy，1996，33：35～ [11]ShiBJ al,J6嗍ViroZ．I997．78|I]81~I185 维普资讯 42 —— 《生命 的化学~1997年 l7卷 6期 l_2．2 间接荧光测定 光强度来测定蛋 白酶的活性。 为了改善 灵敏度 ，DNA一组 蛋 白的结合 为了消除样品中可能存在的荧光物质对 在 500~lEppendorf管中进行 向Eppendor[ 测定结果的影 响，在分析系统 中设置一个与 管 中加入 1．2ml含 0．5／~g／ml溴 乙锭 的 分析柱完全一样的对照柱 ．仅 以分离胶代替 pH8．0的 rrig缓冲液 ，10／~1DNA一组 蛋 白混 FITC—BSA一分离胶 待测酶液通过分析柱测 合 液 含 1_5g组 蛋 白和 0．5gDNA ，于 得的荧光强度 ，减去待测酶液通过对照柱所 37oc保温 5分钟，充分混匀后，取样 1OI加 测得 的荧光强度 ，即为酶实际水解的荧光素 入荧光管中，再加入 1O 蛋 白酶混匀后 ，测 的荧光强度。 定荧光增量。 2．2 测定程序 1_3 本方法的特点 首先用 FITC标记 BSA，然后偶联到用 1_3．1灵敏度高，足以在纳克水平定量 FMP活化的分离胶上．制成分析柱。将分析 测定多种蛋 白酶活性。如可检测 1O‘个细胞