乳酸乳球菌镉抗性质粒的鉴定及镉抗性功能片段的获取.pdf

第lO卷第3期 中国食品学报 V01．10No．3 20 1 0年6月 ofChineseInstituteofF00dScienceand Jun．2Ol 0 Joumal Techn0109y 乳酸乳球菌镉抗性质粒的鉴定及镉抗性功能片段的获取 范丽平-王亚峰z霍贵成弘 (1杭州万向职业技术学院生物技术系杭州3100232杭州娃哈哈集团有限公司研发中心杭州310018 3乳品科学教育部重点实验室(东北农业大学)哈尔滨150030) 摘要 为获得乳酸茵食品级筛选标记基因。通过质粒消除、PCR方法和电转化方法鉴定一个镉抗性质粒 pCD077。酶切分析结果显示该质粒是一个50kb以上的大质柱。结合PCR及热不对称嵌套PCR的方法获得镉 抗性功能片段，为以镉抗性为筛选标记构建乳酸茵食品级我体奠定了基础。 关键词乳酸乳球菌；质粒；镉抗性片段 文窜编号1009—7848(2010)03一0205-08 acid 乳酸菌(1acticbacteria)具有广泛的应用酸乳球菌镉抗性相关基因定位在质粒上闻。本文 rec． 在前期质粒消除试验初步确定乳酸乳球菌镉抗性 价值，是目前研究最深入的安全型(龋nerallv as 质粒的基础上嘲．通过PCR和电转化方法鉴定镉 ognizedsafe，GRAS)微生物，在食品工业和医 疗保健等领域有着广泛的应用。然而自然乳酸菌 抗性质粒，结合PCR及热不对称嵌套PCR方法获 往往不具备工业生产所需的各种优良性状或者性 取镉抗性功能片段。旨在为以镉抗性为筛选标记 状不显著．传统的定向培育、诱变育种和细胞融合 构建乳酸菌食品级载体奠定基础。 等育种方法存在工作量大、周期长、效率低、可利 用基因资源有限等弊端。随着分子生物学理论和 1材料与仪器 技术的发展．通过基因丁程方法选育乳酸菌优良 1．1 材料 菌株成为新的研究方向㈣。此外。挖掘乳酸菌的潜 1．1．1 菌株与质粒 大肠杆菌JMl09，乳品科学 在应用价值，如作为口服疫苗载体等【3l，都需要采 教育部重点实验室保存：乳酸乳球菌KI．DS4．0319 用基因工程方法改良乳酸菌。无论是利用基因工 和乳酸乳球菌KLDS4．0319—5分别为乳品科学教 程方法进行菌种改良．还是挖掘乳酸菌潜在的应 育部重点实验室研究人员鉴定的镉抗性菌株和无 用价值都需要食品级的载体系统。以蔗糖发酵基 质粒菌株【9】：乳酸乳球菌KLDS4．0319—6。本试验 因、乳糖发酵基因、胸苷酸合成酶基因、丙氨酸消 中获得的镉抗性质粒转化子；pMDl8一T载体购自 旋酶基因、tRNA抑制基因等作为选择性标记已成 功构建乳酸乳球菌食品级载体．然而这些载体必 的镉抗性质粒。 需有相应基因的缺陷型菌株作为克隆受体【4】。 1．1．2培养基、试剂与工具酶大肠杆菌用LB培 乳酸菌镉抗性选择标记是澳大利亚Liu等人 养基，37℃培养；乳酸乳球菌用GMl7培养基，30 最先研究的【习。其机理是镉抗性基因编码P型 Cd2LATPase．利用水解ATP获得的能鼍使镉离子 逆浓度跨膜转运，即由细胞内释放到细胞外，避免 细胞内积累高浓度镉离子而致死。有研究表明乳 mmol／IJ 基中分别添加20mmol／I．MgCl2和2Ca． C12，115℃灭菌15min)用于乳酸乳球菌电转化试 收稿日期：2009一06—26