猪传染性胃肠炎病毒S蛋白在毕赤酵母中的分泌表达及免疫原性分析.pdfVIP

’． 目 录 QOOOO………………………000000000Baoooo……………IV 符号说明……………O 中文摘要……………………………………………………………………1 英文摘要……………………………………………………………………3 l弓I言………………·………··……………………………………………5 1．1猪传染性胃肠炎的研究进展……………………………………………5 1．2巴斯德毕赤酵母表达系统在异源蛋白表达中的应用………………16 1．3花青素的药理作用研究进展…………………………………………21 1．4研究的目的、意义………………………………………………………26 2材料与方法………………………………………………………………28 2．1材料……………………………………………………………………28 2．1．1药物……………………“………………………………···…·……28 2．1．2毒株、菌株、细胞和质粒……………………………………………28 2．1．3酶和试剂………………………………………………………………28 2．1．4引物设计与合成………………………………………………………29 2．1．5试验所用溶液及其配制………………………………………………29 2．1．6主要实验仪器设备及耗材……………………………………………33 OOOO……………………33 2．2．花青素体外抗TGEV的试验研究方法…OO 2．2．1STcell的复苏与培养………………………………………………34 2．2．2TGEV病毒的增殖…………………………………………………34 2．2．3病毒基因组RNA的提取……………………………………………34 2．2．4RT-PCR鉴定…………………………………………………………34 OOOOO……………··OOQQOQOOIOOOOOOO……………35 2．2．5病毒TCID50的测定…Q 2．2．6免疫酶过氧化物酶单层细胞实验……………………………………36 2．2．7花青素对ST细胞的毒性作用一细胞形态学观察…………………37 2．2．7．1花青素对ST细胞上贴壁的影响……………………………………37 ao·………………37 2．2．7．2花青素对ST单层细胞的影响…………………a moooo………………38 2．2．7．3花青素在ST细胞上最大安全浓度的确定……m 2．2．8花青素在ST细胞上对抗TGEV的最佳用量的确定…………………38 2．2．8．1药物的稀释…………………………………………………………38 2．2．8．2TGEV的稀释………………………………………………………38 OOOOO……………38 2．2．8．3细胞的培养与病毒接种…………………………B 2．2．9花青素在细胞上对TGEV的抑制作用………………………………38 2．3 TGEV S蛋白在毕赤酵母中的分泌表达及免疫原性分析的方 法…………………………………………………………………··………·38 2．3．1目的基因的PCR扩增………………………………………………38 2．3．2 PCR产物的回收………………………………………………………39 2．3．3克隆载体TS的构建与鉴定…………………………………………39 2．3．3．1目的片段与pBS．T载体的连接……………………………………39 2．3．3．2连接产物的转化……………………………………………………40 2．3．3．3质粒DNA的少量制备一碱法提取质粒……………………………40 2．3．3．4重组质粒的鉴定……………………………………………………41 2．3．4表达载体pPIC9K．S的构建和鉴定…………………………………4l 2．3．4．1表达载体pPIC9K．S的构建………………………………………4l 2．3．4．2连接产物的转化……………………………OO@O@O…………………4