若干基因调控信息检测新技术.pdf

中文摘要 摘要 细胞水平的信息传递和调控是研究各种细胞行为的基础，如细胞分裂与增殖、细胞分化 以及细胞凋亡等等。本文进行了若干基因调控信息的检测新技术的研究。提出了几种研究 DNA结合蛋白以及DNA甲基化定量检测的新方法。 一、DNA与蛋白质之间的相互作用的检测新方法研究 许多细胞调控功能启始于DNA结合蛋白与其相对应的DNA发生特异性的结合，例如 转录调节，DNA复制，基因的重组，DNA的错配识别和修复等等。因此，为了更好的研究 细胞的功能和基因表达调控的机理，对于DNA结合蛋白的检测以及蛋白结合序列的特征的 研究就显得非常重要。 在本文中，我们研究并发展出两套完整的新型DNA结合蛋白的检测方法： (1)基于外切核酸酶ⅡI和SYBR-Green l染料技术的DNA结合蛋白检测方法 在此工作中，我们发展了一种简单的，便宜的，灵敏的检测技术，用于检测序列特异性 的DNA结合蛋白。这项技术采用了Exonuelease GreenI(sG)双 III(ExoIID足迹和SYBR 链DNA染色的方法来检测DNA结合蛋白的结合活性。在这项技术中，我们设计了与蛋白 特异性结合的双链DNA探针，此双链探针的一端为蛋白的结合位点，另一端具有突出的3’ 末端(5个突出的胸腺嘧啶T)，用以阻止ExoHl从这个方向上的酶切。如果存在被检测的 结合蛋白，那么该结合蛋白会特异性的结合到双链DNA探针的相应结合位点上，从而通过 物理上的空间位阻作用，阻止ExolII酶的与探针的结合以及该的切割。这样被保护住的探 针就可以在SG荧光染料的作用下产生荧光。反之，没有结合蛋白保护的双链探针将会被 ExolII降解。SG因无法与DNA探针结合，则不显示荧光信号。在这项工作中，我们将此 检测方法成功的应用在于核抽提物中检测转录因子NF-r．B。我们同时通过这种技术衡量了 NF-r．B与不同序列的结合活性。综上，我们将这种方法命名为ExollI-Dye-bascdassay。这种 技术因其简单，廉价和快速可以被广泛的应用于各种需要检测DNA结合蛋白的生物医学领 域。 (2)基于实时定量PCR技术的超灵敏DNA结合蛋白定量检测方法 上一项工作中我们发展了一种简单，廉价和快速的DNA结合蛋白检测方法。但是该方 法具有一些局限，如：只具有普通的检测灵敏度(riM级)以及无法精确的定量检测。因此， 在进一步的工作中，我们发展了另一种具有高灵敏度和高定量性的DNA结合蛋白检测技术。 这个系统是将ExoRI足迹和实时定量PCR扩增技术完善的结合起来，同时该检测过程不同 于ImmtlnoPCR，因为其不需要蛋白的特异性抗体的参与。在这项技术中，我们通过Tailed PCR技术制作的双链DNA模版序列。既具有蛋白结合位点(正向序列的5’端)，同时具有 中文摘要 特异性扩增的区域。当结合蛋白存在的时候，会结合到此双链DNA模版上的特定区域，从 而保护双链DNA的反向序列的3’端不受ExoHI的攻击。进而保留下一条完整的单链DNA 模版序列用于进行接着的定量PCR扩增。相反，当没有结合蛋白保护的时候，DNA模版的 两条链都会受到ExollI的降解，从整个模版都被破坏而无法被定量PCR扩增。此工作中， 利用这种检测方法．我们在Hela细胞核抽提物中检验了lO种不同的转录因子。其结果显示 该方法具有良好的稳定性和定量效果，且其灵敏度达到fM级。由于这项技术便于使用者自 己设计和定制所需检测蛋白的相应探针，并且操作时间和复杂度都不高。因此这种高灵敏度 和高定量的检测新技术可以被使用到各种科研，医疗诊断和药物发现中去。 二、基于通用TaqMan技术的DNA甲基化定量检测的新方法研究 真核生物体内的DNA甲基化属于一种DNA修饰作用，是重要的转录水平上的基因调 控方式，在细胞分化、发育及增殖过程中起着十分重要的作用。研究表明，肿瘤细胞中基因 组总体甲基化水平的降低和某些基因启动子区发生过甲基化是肿瘤最早，也是最常见的分子 改变之一。异常DNA甲基化通常发生在CG密集区，称之为cpG岛，通常位于基因的控制 区及第一外显子区。异常DNA甲基化与肿瘤抑制基因的转录失