人体rna旋酶a(rha)与依诺沙星对rna干扰的共增强效应研究.pdf

摘要 摘要 RNA干扰目前已经成为哺乳动物细胞中研究特定基因功能的主流分子生物 学手段。大规模的基于RNA干扰的分析方法受到脱靶效应以及干扰素响应等现 象的影响，产生假阳性结果，这主要是由使用高浓度的siRNA所导致。但在RNA 干扰实验中，降低siRNA的浓度会伴随着基因沉默效率的降低。所以如何寻求 适当的siRNA的使用量并得到真实的干扰效果，成为了使用RNA干扰技术的 重要问题。本文正是着眼于RNA干扰机制中这样的现状，提出影响RNA干扰 效率的一个重要因素是双链siRNA的稳定性。我们猜测：RNA解旋酶的抑制剂 可以通过抑制RNA干扰途径中的解旋酶家族蛋白，从而增强双链siRNA的稳定 性，实现对RNA干扰效果的增强。 氟化喹诺酮类化合物因为具有抑制细菌II型拓扑异构酶(例如：革兰氏阴 性细菌中的DNA解旋酶以及革兰氏阳性菌中的DNA拓扑异构酶Ⅳ)活性而被 作为广谱抗生素使用。本实验室张强哲和张彩红老师已经得到依诺沙星对RNA 干扰有增强效应的结论。在此基础上，我的工作主要有以下三个部分： 一、对于依诺沙星增强RNA干扰的靶标做出了进一步的猜测和论证：通过 诺沙星对于RNA干扰的共激活效应，并且这种效应也是具有浓度依赖性的。这 为探寻依诺沙星增强RNA干扰效应的靶标提供了证据： 二、将人体RNA解旋酶A按照功能结构域分别构建在真核表达载体中，在 HEK293A细胞体系中验证不同结构域的过量表达与依诺沙星对于RNA干扰的 协同增强效应。实验结果显示：不同功能结构域与依诺沙星的协同增强效应不 box)对RNA干扰 如RHA全酶的增强效应明显，但是个别结构域(如：RGG 有增强效应。这为我们进一步探索RNA干扰途径中人体RNA解旋酶A(RHA) 的功能提供了手段； 三、人体RNA解旋酶A(RHA)的原核表达纯化：通过对不同原核表达载 摘要 体和菌株的选择和尝试，我们得到了以包涵体表达的全长人体RNA解旋酶A。 并尝试了初步的变性纯化和复性手段，但是遗憾的是我们没有得到具有活性的 全长RHA。这也为我们尝试利用大肠杆菌体系表达和纯化大分子量，含有较多 稀有密码子的真核蛋白提供了一些思路。 关键词：IⅢA干扰，脱靶效应，氟化喹诺酮类化合物，依诺沙星，双荧光 原核表达 素酶报告系统，人体RNA解旋酶A， n Abstract Abstract RNAi hasbecomeamainstreammoleculartoolfor the technology assessing in RNAi-based ofdifferent mammalian functions genes cells．Large-scaleanalyses areoften false and resultsdueto effectsand interferingby positivenegative off-target in totheuseof concentrationsofsiRNA． interferon atleast high response，owingpart amountsofsiRNAsandshRNAscan and the effec