筛选应用于β-中海贫血基因治疗中的高效转导杂合型AAV载体.pdfVIP

摘要 目的： 本研究优化构建包装纯化携带标记基因GFP的重组杂合型丸w 载体，用各重组杂合型丸W载体感染来源于人的造血干／祖细胞， 筛选高效转导人的造血干／祖细胞的杂合型AAV载体，以此构建携带 p．珠蛋白基因的杂合型AAV载体，转导流产的p．重型地贫胎儿骨髓 源造血干／祖细胞，将转染后的细胞移植入照射裸鼠体内，系统检测 受体鼠内人p．珠蛋白基因的表达水平，筛选出高效转导的杂合型 心载体。 方法与结果： 1．造血干／祖细胞和间充质干细胞的分离培养 本研究采用密度梯度离心法结合免疫磁珠分离法获取人造血干 ／祖细胞，流式检测分离纯度，集落培养检测分化潜能和生物学活性； 密度梯度离心法结合贴壁法体外培养获取人骨髓MSCs，分别诱导 MSCs向成脂肪和成骨分化。结果表明通过免疫磁珠分离法可以获得 高纯度的造血干／祖细胞，集落培养说明其具有较高的分化潜能和生 物学活性；体外原代和传代培养可获得高效扩增能力的MSCs。 2．重组腺相关病毒载体的获得 本研究中通过磷酸钙共沉淀，三质粒共转染，肝素．琼脂糖法包 装纯化含有目的基因的rAAV病毒载体；通过SDS．PAGE蛋白电泳， 点杂交检测，细胞感染等检测rAAV的纯度、滴度和生物活性。结 果表明包装纯化的rAA