半滑舌鳎(Cyoglossu semilaevis)两种抗菌肽和细胞因子Midkine的克隆与表达分析.pdfVIP

semilaevis)两种抗菌肽 半滑舌鳎(Cynoglossu 和细胞因子Midkine的克隆与表达分析 摘要 本研究以实验室已构建的半滑舌鳎cDNA文库为基础，利用RACE技术、 因子Midldne基因全长，并通过研究这三个基因的序列，基因结构，正常组织、 发育时期和免疫刺激下的表达情况，体外表达及活性检测等方面，为进一步研究 奠定基础，现将主要研究结果分述如下： cDNA序列由1715-UTR，291ORF和151 半滑舌鳎CsHepcidin bp bp bp 3-UTR组成，预计编码96个氨基酸残基的前体，该前体由信号肽，前体肽和成 熟肽组成，成熟肽具有保守的8个半胱氨酸残基。hepcidin基因全长由3个外显 子和2个内含子组成，内含子2存在一个三碱基ACA重复的微卫星。序列、基 l家族成员。荧光定量 因组结构和进化分析均表明CsHepcidin是鱼类hepcidin 量较高，而在胚胎和仔鱼发育过程中，孵化后6dCsHepcidin显著增加，而在变 态期则明显降低，暗示CsHepcidin的表达受半滑舌鳎胚胎发育的调节，并可能 参与半滑舌鳎变态期发生的复杂的生理生化过程。鳗弧菌免疫刺激后， 在半滑舌鳎对外界刺激和病原生物侵袭的防御过程中有不可忽视的作用。为研究 组蛋白对多种菌株的生长都有不同程度的抑制作用，尤其是对海洋致病菌鳗弧 菌、迟缓爱德华氏菌等效果比较明显，而对革兰氏阳性菌株金黄色葡萄球菌的抗 菌能力则较弱。 半滑舌鳎抗菌肽NK-Iysin基因全长1516bp，由5个外显子和4个内含子组 成，其cDNA序列全长683 47 408 228 bp，包括5-UTRbp，ORFbp和3-UTRbp， 预计编码135个氨基酸残基组成的分泌性蛋白，成熟肽具有6个保守的半胱氨酸 B结构域。同源性分析表明 残基以及一个SAPLIP家族典型特征的Saposin 则很低。CsNK．1ysin保守的蛋白结构、序列特征和相似的三级结构暗示 CsNK。lysin可与入侵病原菌相互作用，并显示抗菌活性。本研究中发现由于内含 子4的不正常剪切，半滑舌鳎中CsNK。lysin存在三种剪切型，三者的C端序列 表达具有一定相似性，均在小肠和心脏中表达水平较高。鳗弧菌免疫刺激后， CsNK-lysin三种剪切型在小肠、脾脏和头肾中的表达呈现不同模式，表明 CsNK．1ysin可能参与半滑舌鳎的非特异性免疫过程，但具体的调控机理尚不明 确。 半滑舌鳎细胞因子Midkine基因全长3541bp，由5个外显子和4个内含子 159 504 组成。CsMidkineeDNA序列全长1098bp，包括5-UTRbp，3-UTRbp 以及ORF 435bp，预计编码144个氨基酸残基组成的分泌性蛋白，成熟肽富含半 CsMidkine基因的5’侧翼邻接甘油二酯激酶基因，并存在视黄酸受体结合位点、 录因子结合位点。荧光定量PCR显示CsMidkine在成鱼脑组织中特异性表达， 而在半滑舌鳎胚胎发育过程中，CsMidkine表达量在原肠胚中期开始显著增加， 在神经胚和脑部分化时期其表达都有显著变化。整体原位杂交显示CsMidkine主 要集中在坯胎头部表达，在未来的间脑、中后脑边界(MHB)和后脑一直存在 高强度的杂交信号，个别区域信号变化，如神经管。从表达时间、表达分布结合 系统进化树综合分析，推测半滑舌鳎CsMidkine属于MKb分支，参与半滑舌鳎 PCR法对半滑舌鳎Midkine成熟肽进行定 脑部的发育和分化过程。利用SOEing 点突变，并利用原核表达体系对其进行了重组蛋白的诱导表达，重组蛋白主要以 可溶形式存在于上清中。在鲆鲽鱼类中诱导