半滑舌鳎MHCII类基因的克隆、与抗病相关性及遗传连锁分析.pdf

半滑舌鳎MHCII类基因的克隆、与抗病相关性及遗传连锁分析 摘 要 semilaevis)是一种重要的经济鱼类，在我国沿海的 半滑舌鳎(Cynoglossus 鱼类养殖中占有重要地位。养殖中的半滑舌鳎会面临很多病原的侵袭。因此，为 了解其重要免疫基因，从根本上提高鱼体自身的抗病能力，我们克隆了主要组织 相容性复合体(MHC)的II类基因，并研究了彳基因的开放阅读框(open reading frame，ORF)多态、基因结构及B基因在不同发育时期的表达；对200尾个体 进行了鳗弧菌注射实验，以期找到与抗鳗弧菌感染相关的等位基因；同时利用3 个家系研究了II类基因的不同等位基因之间的连锁关系。主要结果如下： 1．II类的两个B基因在不同发育时期的表达 之前的研究结果表明，在半滑舌鳎中B基因有两个，即Cyse．DAB和 Cyse—DBB。用这两个B基因的特异引物分别对半滑舌鳎的19个发育时期进行扩 增，结果发现两个B基因的表达不同。相同条件下，Cyse—DAB在受精后至胚环 期未检测到表达，从尾牙期表达开始上升并持续到孵化后2d，而后在孵化后5d 表达下降，在16d未检测到；在未变态时期表达量很高；Cyse．DBB在从未受精 卵开始一直到孵化后2d均有持续表达，到孵化后5d表达未检测到，在孵化后 16d表达量很大；两个B基因都随着变态的进行表达量下降，处于正在变态时期 的表达量较小，而后随着变态的结束，表达量逐渐恢复，在56d和87d仔鱼时期 表达量均较大。两个B基因在发育早期的不同表达情况说明在这些时期两个B 基因可能发挥不同的功能或功能互补。 2．II类A基因的克隆、ORF多态和基因结构 利用同源克隆技术，从半滑舌鳎的脾脏中克隆得到了A基因的cDNA全长， 主要组织相容性复合体蛋白标签和保守的半胱氨酸残基；二级结构显示其为混合 型蛋白。序列比对和进化树分析显示，半滑舌鳎的该蛋白和大菱鲆、牙鲆、大西 洋庸鲽的亲缘关系最近。 对9个个体进行了么基因的ORF扩增，得到了25种多肽序列，序列比对和 进化树分析显示这些多肽序列差异明显，分为两类，应为两个基因，将其分别命 异氨基酸分别为Asn91、Ser92、ser94、Gly95、Lysl 半滑舌鳎MHCII类基因的克隆、与抗病相关性及遗传连锁分析 94 Glu／Gln 彳基因构建进化树发现，半滑舌鳎的这两个彳基因的各等位基因分别聚在一起， 形成两个分支；随后与其它物种的彳基因聚在一起；提示这两个A基因是在半 滑舌鳎与其它物种分离后才产生的。 对两个A基因的基因全长扩增显示，两个爿基因均由4个外显子和3个内 含子组成，外显子的分布和长度一致，但内含子差异明显：Cyse．DAA的内含子 两个A基因；两个A基因的内含子1和3没有明显差别，且内含子3最为保守， 均为90bp；内含子1含有一个重复次数约为100次的(GTCA)微卫星序列。 3．感染实验和抗病／易感等位基因的查找 对200尾半滑舌鳎进行腹腔注射鳗弧菌实验，取最先死亡的20尾个体和活 跃的20尾个体进行分析。每个个体每个基因各挑取5个克隆进行测序。共发现 为28个；两个B基因有各自特异的核苷酸和氨基酸；发现了13种Cyse—DAB的 内含子1和1 显著，但是这四个等位基因很可能与抗鳗弧菌感染的抗性相关，因为它们仅在存 活个体中被发现，且在多于一个个体中被发现。 根据得到的外显子2、3的的氨基酸序列共发现了85种彳基因的多肽序列， 异氨基酸保守；两个彳基因的内含子2长度保守，本实验中得到了3种Cyse．DAA 的内含子2和6种Cyse．DBA的内含子2，差异主要为单核苷酸变异；虽然没有 因Cyse．DBA*l 高，可能与抗鳗弧菌感染的敏感性相关；而Cyse—DAA的等位基因 1 Cyse—DAA木0201、Cyse—DAA木1 半滑舌鳎MHCII类基因的克隆、与抗病相关性及遗传连锁分析 比在死亡个体中出现的频率高，因而可能与抗鳗弧菌感染的抗性有关。 4II类基因的等位基因的连锁分析 虽然用An酶切半滑舌鳎基因组后的Southern杂交结果显示B基因只有一 条大于10kb的条带出现，但是序列分析仍然支